Floresan RNA aptamer çeşitlendirilmesi amacıyla crıspr-aracılı hücre-içi yönlendirilmiş evrim platformu geliştirilmesi
Development of a crispr-mediated intracellular directed evolution platform for fluorescent RNA aptamer diversification
- Tez No: 978882
- Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ MUTLU ERDOĞAN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Ankara Üniversitesi
- Enstitü: Biyoteknoloji Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
RNA'ların hücre içindeki işlevselliği, katlanma, translokasyon ve degradasyon gibi dinamik süreçlerle düzenlenir. Genetik olarak kodlanmış floresan RNA aptamerleri, canlı hücrelerde hedef RNA'nın dinamiklerini gerçek zamanlı olarak izlemek için benzersiz araçlardır. Ancak mevcut hücre dışı in-vitro teknolojilerle geliştirilen aptamerler, zorlu hücresel ortamla uyumsuzlukları nedeniyle düşük hücre içi stabilite ve parlaklık göstererek kısa hücre içi yaşam süresine sahiptir. Bu çalışmada hedefimiz, üstün hücre içi stabiliteye ve artırılmış parlaklığa sahip floresan bir RNA aptameri üretmek amacıyla memeli hücre tabanlı bir yönlendirilmiş evrim platformu geliştirmektir. Stratejimiz temelde hedef aptameri kodlayan gende CRISPR/Cas9 aracılığıyla çift sarmal kırıkları (DSB) oluşturmak üzerinedir. Bu DSB'ler, DSB ile aktive olan DNA onarım mekanizmalarını aktive ederek ilgili aptamer geninin çeşitlendirilmesini sağlayacaktır. Yakın zamanda tanımlanan Pepper aptameri üzerinde yürüttüğümüz çeşitlendirme deneylerinde, Pepper dizisini kırmızı floresan protein mRuby3'ün 3′ucuna bir memeli ifade vektörü olan pcDNA5/FRT vektörüne klonladık ve pcDNA5/FRT/mRuby3-Pepper yapısını Flp/FRT rekombinasyonu ile Flp-In-293 hücre hattına stabil olarak entegre ettik; Pepper dizisinin CRISPR/Cas9 ile çeşitlendirilmesi bu stabil hücre hattında gerçekleştirildi. DSB'ler ile oluşturulan mutasyonlar önce T7 Endonükleaz I Assay ile doğrulandı, ardından mutasyona uğramış bölgeler plazmid vektörlere klonlandı ve Sanger dizilemesiyle mutasyon spektrumu incelendi. Sonuç olarak, hücre tabanlı bir yönlendirilmiş evrim platformu geliştirdik ve CRISPR/Cas9 kullanarak Pepper floresan RNA aptamerini geliştirilmiş bir varyant geliştirebilmek amacıyla çeşitlendirdik.
Özet (Çeviri)
Functionality of RNAs in cells is organized by the dynamic processes such as folding, translocation and degradation. Genetically encoded fluorescent RNA aptamers are unique tools for realtime tracking of the dynamics of an RNAofinterest in live cells. However, despite being promising, aptamers developed with current cellfree in vitro technologies have major shortcomings such as low intracellular stability and brightness, due to their incompatibility with the harsh cellular environment causing short intracellular lifetime. Our study aims to develop a mammalian cellbased directed evolution platform to engineer a fluorescent RNA aptamer of superior intracellular stability with enhanced brightness. Our strategy is based on creating doublestrand breaks (DSBs) with CRISPR/Cas9 on the target gene encoding the aptamer. These DSBs lead to diversification of the aptamer gene through the DSBactivated DNA repair mechanisms. We then apply a highthroughput directed evolution scheme to enrich the variant cells that express improved variants. We perform our diversification experiments on the recently developed Pepper aptamer. We cloned Pepper gene sequence at the 3' end of the mRuby3, a red fluorescent protein used as an expression marker, in the pcDNA5/FRT mammalian expression vector. The pcDNA5/FRT/mRuby3Pepper construct is then stably integrated into the genome of FlpIn293 cells using Flp/FRT recombination. CRISPR/Cas9mediated diversification of the Pepper sequence is performed in the stable mRuby3Pepper FlpIn293 cell line. DSBinduced mutations are initially examined by T7 Endonuclease I assay using the genomic DNA library. Next, the mutated regions are cloned into plasmid vectors for Sanger sequencing to inspect the mutational spectrum. Overall, we have developed a cellbased directed evolution platform and diversified the fluorescent Pepper RNA aptamer via CRISPR/Cas9 to engineer an improved variant.
Benzer Tezler
- Model bı̇r yeşı̇l flöresan proteı̇n ı̇çı̇n aptamer üretı̇mı̇nı̇n ve optı̇k bı̇yosensörlerde uygulanmasının araştırılması
Investigation of aptamer production for a model green fluorescent protein and its application to optic biosensors
DİLBER ECE AKGÜN
Yüksek Lisans
Türkçe
2013
BiyomühendislikHacettepe ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MEHMET MUTLU
- Aptamer mediated cytotoxicity of drug carrying silica nanoparticles
İlaç taşıyan silika nanopartiküllerin aptamer aracılığıyla oluşturduğu sitotoksisite
GÖKTUĞ KARABIYIK
Yüksek Lisans
İngilizce
2018
BiyoteknolojiYeditepe ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ BİLGE GÜVENÇ TUNA
DOÇ. DR. SONER DOĞAN
- Serviks kanser tedavisi için aptamer hedefli eksozom aracılı lizozomotropik etkili biyoteknolojik ilaç geliştirilmesi
Development of biotechnological drugs with aptamer targeted exosome-mediated and lysosomotropic effective for the treatment of cervical cancer
ÖMER ERDOĞAN
Doktora
Türkçe
2022
BiyoteknolojiAydın Adnan Menderes ÜniversitesiBiyokimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ÖZGE ÇEVİK
- Selection and validation of aptamers against osteosarcoma by cell-selex method
Osteosarkoma karşı aptamerlerin hücre-selex yöntemi ile seçimi ve sınanması
KHALIUNSARNAI TSOGTBAATAR
Yüksek Lisans
İngilizce
2019
Mühendislik BilimleriHacettepe ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. EDA ÇELİK AKDUR
DOÇ. DR. LIGIA RODRIGUES
- The impact of ions on RNA aptamer-aminoglycoside interactions
RNA yapılı aptamerlerin aminoglikozitlerle etkileşiminde metal iyonlarının etkisi
REZZAN FAZLIOĞLU
Yüksek Lisans
İngilizce
2019
BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ MÜSLÜM İLGÜ
DOÇ. DR. CAN ÖZEN