Production of phenylpyruvic acid and phytase by microbial fermentation
Fenilpirüvik asit ve fitazın mikrobiyal fermantasyonla üretimi
- Tez No: 711403
- Danışmanlar: PROF. DR. ALİ DEMİRCİ
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyomühendislik, Bioengineering
- Anahtar Kelimeler: Fitaz, Matematiksel modelleme, Mikrobiyal fermentasyon, Süreç optimizasyonu, Phytase, Mathematical modelling, Microbial fermentation, Process optimization
- Yıl: 2014
- Dil: İngilizce
- Üniversite: The Pennsylvanıa State Unıversıty
- Enstitü: Yurtdışı Enstitü
- Ana Bilim Dalı: Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Biyomühendislik Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Yem ve gıda katkı maddeleri, diyetlerin kalitesini artırmak için endüstride oldukça popülerdir. Besin kalitesini arttırma, renklendirme, lezzet arttırma, antimikrobiyal etkiler, koyulaştırma, stabilizasyon, raf ömrünü arttırma ve kalori azaltma gibi çeşitli uygulamalar için kullanılırlar. Bunların arasında fenilpiruvik asit (PPA) ve fitaz, önemli yem ve gıda katkı maddelerinden sadece ikisidir. PPA ve fitazın endüstride oldukça önemli uygulamaları vardır. PPA, çevre üzerindeki olumsuz etkileri önleme amaçlı gübrede aşırı azot birikimini azaltmak için yemlerde fenilalanin yerine deneysel olarak kullanılmaktadır. PPA ayrıca böbrek hastalarının diyetlerinde vücuttaki üre birikimini azaltmak için de kullanılmaktadır. Ek olarak, PPA, peynir ve şarap üretimi için belirli bir tat ve aroma oluşturmak için çok önemli bir bileşik olarak da kullanılmaktadır. Fitaz ise, bağırsakta iki değerlikli iyonları, amino asitleri ve proteinleri bağlayaran bir anti-besin maddesi olan fitatı parçalar. Ayrıca fitaz, flora ve faunanın değişmesine neden olabilecek gübrede aşırı fosfor birikimini azaltmak için tek mideli hayvanların beslenmesinde kullanılan önemli bir katkı maddesidir. Bu nedenle, bu araştırmanın amacı, büyüme ve fermantasyon ortamı parametrelerini optimize ederek ve ayrıca biyoreaktörlerde çeşitli fermantasyon modları yürüterek PPA ve fitaz üretimlerini arttırmaktır. Ek olarak, iki mikropartikülün (talcum ve alüminyum oksit) fungal fitaz üretimi üzerindeki etkisi de incelenmiştir. PPA fermantasyonu için ilk olarak literatür taramasına dayalı olarak dört mikrobiyal suş (Morganella morganii, Zygosaccharomyces rouxii, Proteus vulgaris ve Corynebacterium glutamicum) kullanılarak suş seçimi yapılmış ve çalkalamalı flask PPA üretiminde en iyi mikroorganizma olarak P. vulgaris seçilmiştir (358 mg/L). Daha sonra sıcaklık, pH ve havalandırma gibi büyüme parametreleri PPA ve biyokütle üretimi Response Surface Methodology (RSM) kullanılarak biyoreaktörlerde optimize edildi. Optimum koşullar PPA üretimi için 34.5°C, 5.12 pH ve 0.5 vvm havalandırma, biyokütle üretimi için 36.9oC, pH 6.87 ve 0.96 vvm havalandırma olarak belirlendi. Optimum koşullar altında 1054 mg/L PPA ve 3.25 g/L biyokütle üretimleri elde edilmiştir. ANOVA sonuçları, değerlendirilen tüm büyüme faktörlerinin biyokütle üretimi üzerinde önemli ölçüde (p<0.05) etkili olduğunu, ancak havalandırmanın PPA üretimi için önemli (p<0.05) bir faktör olmadığını göstermiştir. Ek olarak, glikoz, maya ekstraktı ve fenilalanin gibi fermantasyon ortamı bileşenlerinin konsantrasyon seviyeleri RSM ile optimize edildi. PPA üretimi için optimum bileşen konsantrasyonları glikoz için 119.4 g/L, maya ekstraktı için 3.68 g/L ve fenilalanin için 14.85 g/L, biyokütle içinse de163.8 g/L glikoz, 10.75 g/L maya ekstraktı ve 9.84 g/L fenilalanin olarak belirlendi. Bu optimum koşullar altında PPA ve biyokütle konsantrasyonları sırasıyla 1349 mg/L ve 4.35 g/L'ye yükseldi. Ayrıca, PPA üretimini daha da geliştirmek için beslemeli ve sürekli fermantasyon modları gerçekleştirilmiştir. 30 saatlik fermentasyonda reaktöre 4 g fenilalanin ilavesinin PPA konsantrasyonunu 2958 mg/L'ye yükselttiği belirlendi. Ayrıca, sürekli fermentasyonlarda PPA verimliliği 259 mg/L/saate yükseltildi, bu da kesikli fermantasyondaki üretkenliğe kıyasla neredeyse 5 kat daha yüksek olduğu belirlendi. Ek olarak, modifiye Gompertz ve modifiye lojistik modeller ile P. vulgaris'in PPA ve biyokütle üretimi, glikoz ve fenilalanin tüketimi tahmin edilmiştir. Modeller, PPA ve biyokütle üretimlerini fazla tahmin ederken, fenilalanin ve glikoz tüketim verilerini daha düşük tahmin etmişlerdir. Modifiye Gompertz model, tüm tahminler için modifiye lojistik modele kıyasla daha düşük ortalama kare hata (RMSE) ve ortalama hata (MAE) değerleri ile deneysel verileri daha yüksek başarı ile tahmin etmiştir. Fitaz fermantasyonu için ilk olarak fitaz üretici mikroorganizmalar dört farklı suş (Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus amylovorus ve Aspergillus ficuum) değerlendirilerek taranmış ve bunlardan en verimli olan A. ficuum seçilmiştir. En yüksek fitaz aktivitesi, çalkalamalı flask üretimlerinde 1.02 U/ml olarak ölçülmüştür. A. ficcum fitaz aktivitesi, büyüme parametrelerinin optimizasyonu ile biyoreaktörlerde 2.27 U/ml'ye yükseltilmiş ve optimum koşulların 33°C, pH 4.5 ve 0.9 vvm havalandırma olduğu belirlenmiştir. Tüm bu faktörlerin fitaz üretimi üzerinde önemli derecede etkili olduğu belirlenmiştir. Ayrıca fitaz aktivite optimizasyon testi yapılarak A. ficuum fitaz için optimum pH ve sıcaklık değerleri sırasıyla 5.5 ve 55oC olarak belirlendi. Ayrıca en düşük fitaz aktivite kaybı 4C'de 1 haftasüreyle saklama koşullarında görülmüştür. Ancak, -20oC depolama koşulları, depolamanın 1 haftadan fazla olduğu durumlarda A. ficuum fitaz için daha düşük aktivite kaybı oluşmuştur. Daha sonra, glikoz, Na-fitat ve CaSO4 gibi fitaz fermantasyon ortamı bileşenleri bir sonraki çalışmada optimize edilmiş ve maksimum fitaz aktivitesi, 126 g/L glukoz, 14 g/L Na-fitat ve 1.1 g/L CaSO4 içeren ortamda 3.45 U/ml olarak ölçülmüştür. Ayrıca, kesikli beslemeli fermentasyonlarda glikoz ve fitat ilavelerinin fitaz aktivitesi üzerindeki etkisi değerlendirilmiştir. Fermentasyonların 96. saatinde biyoreaktörlere sırasıyla 45 g glikoz, 5 g Na-fitat ve 10 g Na-fitat eklendiğinde maksimum fitaz aktiviteleri 3.84, 4.63 ve 4.83 U/ml olarak ölçülmüştür. Ayrıca fitazın sürekli fermantasyonu, kesikli fermantasyona kıyasla verimliliği yaklaşık 7 kat arttırılmıştır. Ayrıca alüminyum oksit ve talkın A. ficuum ile fitaz üretimi üzerine etkileri araştırılmıştır. Fitaz aktivitesinin, çalkalamalı flask fermentasyonlarında kontrole (1.02 U/ml) kıyasla 15 g/L alüminyum oksit veya talk ilavesiyle sırasıyla 2.01 ve 2.93 U/ml'ye arttığı ölçülmüştür. Ayrıca, mikropartikül ilavesi, küçük fungal büyümede daha küçük yapılar oluşmasını sağladı ve fermentasyon besiyerinde toplu büyüme önledi. En yüksek fitaz aktivitesi, 96 saatlik fermentasyonda biyoreaktörlerde 15 g/L talk eklenerek 6.49 U/ml olarak ölçülmüştür. Ayrıca talk ilavesinin kesikli besleme ve sürekli fermentasyonlar üzerindeki etkisi de incelenmiştir. Fitaz aktivitesi, 15 g/L talk ilavesiyle kesikli besleme ve sürekli fermentasyonlarda sırasıyla 4.912'den 9.587 U/ml'ye ve 3.3'ten 6.3 U/ml'ye yükselmiştir. Ayrıca maksimum fitaz verimliliği, 15 g/L talk katkılı sürekli fermentasyon ile 0.1 saat-1 seyreltme hızında 0.621 U/ml/saat olarak ölçülmüştür. Son olarak, modifiye Gompertz modeli ve modifiye lojistik model ile fitaz üretimi ve glikoz tüketimi tahmin edildi. Modifiye Gompertz modeli, modifiye lojistik modele kıyasla fitaz aktivitesini biraz daha başarılı bir şekilde tahmin ettiği belirlendi. Modifiye edilmiş Gompertz modeline kıyasla da modifiye lojistik model ile glikoz tahmini için daha düşük MAE ve RMSE değerleri elde edilirken, modifiye Gompertz modeli ile daha yüksek R2 ve eğim değerleri elde edilmiştir. Sonuç olarak, PPA üretimi, kesikli beslemeli çalışmalarda çalkalamalı flask fermentasyonlarına kıyasla neredeyse 10 kat artmıştır. Benzer şekilde, fitaz üretimleri, kesikli beslemeli ve mikropartikül ilaveli beslemeli kesikli fermantasyonlarda, çalkalamalı flasks fermantasyonlarına kıyasla sırasıyla yaklaşık 5 ve 10 kat artmıştır. Bu çalışmalar, PPA ve fitaz üretimlerinin optimizasyon ve yeni fermantasyon yöntemleri kullanılarak önemli ölçüde arttırıldığını açıkça göstermiştir. Ayrıca matematiksel modeller, her iki fermentasyon için mikrobiyal kinetiklerin daha iyi anlaşılmasını sağlamıştır. Bu geliştirmelerle birlikte, mikrobiyal fermantasyon kullanılarak PPA ve fitazın endüstriyel üretimleri artık gerçeğe eskisinden daha yakın olması sağlanmıştır.
Özet (Çeviri)
Feed and food additives are very popular in industry to increase the quality of diets. They have been used for various applications such as nutritional quality enhancing, coloring, flavor enhancing, antimicrobial effects, thickening, stabilization, increasing shelf-life, and calorie reducing.Phenylpyruvic acid (PPA) and phytase are just two of the important feed and food additives. PPA and phytase have important applications in the industry. PPA is being experimentally used as a substitute for phenylalanine in feeds to decrease excessive nitrogen accumulation in the manure to prevent negative effects on the environment. PPA is also used for kidney patient's diets to decrease urea accumulation in the body. Additionally, PPA is a very important compound for cheese and wine production to generate a specific taste and aroma. Phytase breaks down phytate, which serves as an anti-nutrient agent by binding divalent ions, amino acids, and proteins in the intestine. Also, phytase is an important additive in monogastric animals' diet to decrease excessive phosphorus accumulation in the manure, which may cause changing flora and fauna. Therefore, the purpose of this research was to enhance PPA and phytase productions in bioreactors by optimizing growth and fermentation medium parameters, also conducting various fermentation modes. Additionally, the effect of two microparticles (talcum and aluminum oxide) on fungal phytase production was studied. For PPA fermentation, strain selection was first performed using four microbial strains(Morganella morganii, Zygosaccharomyces rouxii, Proteus vulgaris, and Corynebacterium glutamicum) based on a literature search and P. vulgaris was selected as the best microorganism based on PPA production level in shake-flask fermentation, (358 mg/L). Thereafter, growth parameters such as temperature, pH, and aeration were optimized for PPA and biomass production in the bioreactors by using Response Surface Methodology (RSM). Optimum conditions were determined as 34.5°C, 5.12 pH, and 0.5 vvm aeration for PPA production and 36.9o C, pH 6.87, and 0.96 vvm aeration for biomass production. Under optimum conditions, 1054 mg/L PPA and 3.25 g/L biomass productions were obtained. ANOVA results showed that all of growth factors evaluated were significantly (p<0.05) effective on biomass production, however aeration was not a significant (p<0.05) factor for PPA production. Additionally, concentration levels of fermentation medium ingredients such as glucose, yeast extract, and phenylalanine were optimized by RSM. The optimum ingredient concentrations for PPA production were determined as 119.4 g/L for glucose, 3.68 g/L for yeast extract, and 14.85 g/L for phenylalanine, whereas 163.8 g/L glucose, 10.75 g/L yeast extract, and 9.84 g/L phenylalanine were the best for biomass production. PPA and biomass concentrations increased to 1349 mg/L and 4.35 g/L, respectively, under these respective optimum conditions. Furthermore, fed-batch and continuous fermentation were conducted to further enhance PPA production. It was determined that addition 4 g of phenylalanine into the reactor at 30 h of fermentation increased PPA concentration to 2958 mg/L. Also, PPA productivity was increased to 259 mg/L/h in continuous fermentations, which is almost 5 times higher compared to productivity in batch fermentation. Additionally, PPA and biomass production, glucose and phenylalanine consumption by P. vulgaris were predicted with modified Gompertz and modified logistic models. The models overpredicted PPA and biomass productions however lower-predicted phenylalanine and glucose consumption data. The modified Gompertz model predicted the experimental data with lower root mean square error (RMSE) and mean average error (MAE) values compared to modified logistic model for all predictions. For phytase fermentation, first phytase producer microorganisms were screened by evaluating four different strains (Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus amylovorus, and Aspergillus ficuum) and A. ficuum was selected as the most productive strain among them. The highest phytase activity was measured as 1.02 U/ml in shake-flask fermentation. A. ficcum phytase activity increased to 2.27 U/ml in bioreactors by optimization of growth parameters. For phytase production these were determined to be 33°C, pH 4.5, and 0.9 vvm aeration and all the factors were significantly effective on phytase production. Also, optimum pH and temperature values were determined as 5.5 and 55oC, respectively for A. ficuum using a phytase assay. Additionally, the lowest phytase activity loss was seen under 4oC storage conditions for 1 week. However, -20 o C storage conditions provided lower activity loss for A. ficuum phytase when storage was more than 1 week of storage period. Thereafter, phytase fermentation medium ingredients such as glucose, Na-phytate, and CaSO4 were optimized in the next study. Maximum phytase activity was measured as 3.45 U/ml with 126 g/L of glucose, 14 g/L of Na-phytate, and 1.1 g/L of CaSO4. Furthermore, the effect of glucose and phytate additions on phytase activity were evaluated in fed-batch fermentations. Maximum phytase activities were measured as 3.84, 4.63, and 4.83 U/ml, when 45 g of glucose, 5 g of Na-phytate, and 10 g of Na-phytate was added into the bioreactors, respectively, at 96 h of the fermentations. Also, continuous fermentation of phytase increased the productivity almost 7-fold compared to batch fermentation. Additionally, the effects of aluminum oxide and talcum were studied on phytase production with A. ficuum. It was reported that phytase activity remarkably increased by addition of 15 g/L of aluminum oxide and talcum to 2.01 and 2.93 U/ml, respectively, compared to the control (1.02 U/ml) in shake flask fermentations. Moreover, microparticle addition provided small pellets and prevented bulk fungal growth in the fermentation broth. The highest phytase activity was measured as 6.49 U/ml by addition of 15 g/L of talcum in bioreactors at 96 h of fermentation. Also, the effect of talcum addition on fed-batch and continuous fermentations were studied. Phytase activity increased from 4.912 to 9.587 U/ml and from 3.3 to 6.3 U/ml in fed-batch and continuous fermentations, respectively, by addition of 15 g/L talcum. Moreover, maximum phytase productivity was measured as 0.621 U/ml/h at 0.1 h-1 dilution rate with 15 g/L of talcum added continuous fermentation. Finally, phytase production and glucose consumption were predicted with modified Gompertz model and modified logistic model. Modified Gompertz model predicted phytase activity slightly more successfully compared to modified logistic model. Lower MAE and RMSE values were obtained for the prediction of glucose by the modified logistic model compared to the modified Gompertz model, however higher R2 and slope values were obtained by the modified Gompertz model. In conclusion, PPA production increased almost 10 fold in fed-batch studies compared to shake-flask fermentations. Similarly, phytase productions increased almost 5 and 10 fold in fed-batch and microparticle added fed-batch fermentations, respectively, compared to shake-flask fermentations. These studies clearly demonstrated that PPA and phytase productions were significantly enhanced by optimization and using novel fermentation methods. Also, mathematical models provided better understanding of microbial kinetics for both fermentations. With these enhancements, industrial productions of PPA and phytase by using submerged fermentation are now closer to reality than before.
Benzer Tezler
- Süt yerine kullanılan düşük proteinli gıda maddelerinin üretimi ve kullanım alanları
Production of food with low protein which substitutions milk and its using area
IŞIL ÖZER
Doktora
Türkçe
2005
Beslenme ve Diyetetikİstanbul Üniversitesiİç Hastalıkları Ana Bilim Dalı
PROF. DR. FERİHAN ARAL
- Düşük proteinli süt-bazlı fermente bir ürün geliştirilmesi
Development of milk-based fermented product with low protein content
SİNEM BETÜL CANİKLİ
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
Gıda Mühendisliğiİstanbul Teknik ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MERAL KILIÇ AKYILMAZ
- Production of optical gratings and study of surface deformations by holographic methods
Başlık çevirisi yok
F.NECATİ ECEVİT
Yüksek Lisans
İngilizce
1988
Fizik ve Fizik MühendisliğiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiDOÇ. DR. TUNCAY İNCESU
- Production of reflection type volume holograms by using 633 nm laser light
Başlık çevirisi yok
MURAT KAPLAN
Yüksek Lisans
İngilizce
1988
Fizik ve Fizik MühendisliğiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiDOÇ. DR. RAMAZAN AYDIN