Alfa-2 makroglobulin kapan tepkimesi üzerine bir çalışma
A Study on trapping reaction of alpha-2 macroglobulin
- Tez No: 59691
- Danışmanlar: PROF. DR. İNCİ ÖZER
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyokimya, Biochemistry
- Anahtar Kelimeler: Alfa-2-makroglobulin, proteaz inhibisyonu, protein fluoresans rv, Alfa makroglobülinler, Alpha-2-macroglobulin, protease inhibitor, protease fluorescence. VI, Alpha macroglobulins
- Yıl: 1997
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Hacettepe Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyokimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
ÖZET Alfa-2-makroglobulin (a-2-M) geniş spektrumlu proteaz inhibitörü olarak etkiyen ; 725 kDa boyutunda, tetramerik bir plazma glikoproteinidir. Inhibisyon, proteaz etkisiyle a-2-M'in yem bölgesinin kınlması; kırılma sonrasında inhibitor konformasyonunun değişmesi; bu değişim paralelinde kırılmaya neden olan proteazm a-2-M'e enterne olarak devre dışı bırakılması nedeniyle gelişir. Bu çalışmada a-2-M-tripsin tepkimesi tripsin substratı olan N-benzoil arginin etil ester ( BAEE) ile yavaşlatılmış; konformasyon değişikliği protein fluoresansı üzerinden izlenmiştir. Triptofan uyaranı (X= 280 nm) sonucunda alınan fluoresans sinyalinin (X=320 nm) enzim varlığında zamanla arttığı; artışın 2° kinetiğe uyduğu görülmüştür. Denk [a-2-M] ve [E ]; değişken [BAEE] varlığında gözlenen fluoresans artışlarının aşağıdaki denkleme göre değerlendirilmesiyle, a-2-M'deki 1 1 F»-Ft F.-Fo + k r_K^ - 1 1 L Kbaee+BAEE J yem bölgesinin tripsin tarafindan kırılmasıyla ilgili hız sabiti ( k ), 2.1± 0.5x1 07 M'1 sn1 düzeyinde bulunmuştur ( 20 mM potasyum fosfat, pH=7, tamponunda; 25 °C de). Belirlenen hız sabiti ile rapor edilen değerler arasındaki benzerlik (l-2xl07 M"1 sn-1) inhibitörde meydana gelen konformasyon değişikliğinde hız belirleyici kademenin yem bölge kırılması olduğunu doğrulamaktadır. Bunu sınamak amacıyla, tripsin aktivitesi N-a-p-Tosil-L-Lizin klorometil keton ile giderildi. a-2-M, hazırlanan farklı spesifik aktiviteye sahip tripsin popülasyonlan ile titre edildi. Çalışma sonunda a-2-M'e enterne aktivitenin aynı limit düzeye ulaştığı; aktif enzim bağlama stoikiyometrisinin değişmediği görüldü. Böylece ancak aktif enzimin a-2-M'e enterne edilebildiği; aynı enzim için rapor edilen bağlanma stoikiyometrisindeki değişkenliklere a-2-M preparatlanndaki safsızlıklar veya denature a-2-M'in neden olduğu sonucuna varıldı.
Özet (Çeviri)
ABSTRACT Alpha- 2 macroglobulin ( a-2-M), a 725 kDa tetrameric plasma glycoprotein, is a prtinase inhibitor which act on a wide spectrum of proteases. The inhibitory process start with proteolytic cleavage of a bait region in a-2-M. This leads to a change in conformation and thereby to the entrapment of the protease in the inhibitor. The entrapped protease is inactive towards macromoleculer substrates. The present study concerns the reaction between a-2-M and trypsin. The system was slowed down by use of the tyripsin substrate, N- benzoil- L- arginine ethyl ester (BAEE) and the reaction was monitared though changes in protein fluorecence. The enzyme was found to cause a time - dependent increase in intrinsic fluorecence (excitation at 280 nm; emission at 320 nm). The change was found conform to 2° kinetics. Data obtained at [a-2-M] = [E] and variable [BAEE] were analyzed according to equation, 1 1 + k x oe“”Xt *co *“ *o [Kbaee I Kbaee+BAEE J The second order rate constant, k, relating the conformational change was found to be 2.1 ± 0.5 x 10 7 M”1 sec'1 ( 20 mM potassium phosphate, pH 7 ; 25°C). Agreement between k and the preoviousyl reported rate constant based on indirect observations (l^xlO'M1 sec"1) confirms that the rate limiting step in the conformational change must be bait - region cleavage. The trapping reaction was also studied to determine if catalytically inert enzyme could be passively incorporated into a-2-M. To test this, trypsin was inactivated with N-a-p-Tosyl-L-Lysine chloromethyl ketone and a-2-M was titrated with trypsin populations which had different spesific activities. The level of activity internalized by a-2-M was found to approach a constant limit determined by [a-2-M]. Active enzyme binding stoicbiometry was independent of the specific activity of the trypsin preparations. It was concluded that only active enzyme could be internalized and that variations in E : a-2-Mbinding stoichiometry must be caused by the presence of impurities or denatured inhibitor species in a-2-M preparations.
Benzer Tezler
- Amfizemde alfa-1-protez inhibitörü varyantlarının incelenmesi
Determination of alfa-1-protease inhibitor variants in patients with pulmonary emphysema
ÖZDEN ÜNAL
- Amfizemde alfa-1-proteaz inhibitörünün kapasitesinin incelenmesi
Investigation of alpha-1-protease inhibitory capacity in emphys
ZUHAL ADLI
- Alfa-2-makroglobulin saflaştırılması; proteinaz varlığında alfa-2-makroglobulinin diğer inhibitörlerle interaksiyonunun incelenmesi
Purification of alpha-2-macroglobulin, investigation of the interaction of alpha-2-M with the other inhibitors in the presence of proteinase
OYA ORTAPAMUK
- Çocukluk çağı nefrotik sendromlu hastalarda alfa-2 makroglobulin ve lipoprotein (a)'nın araştırılması
Investigation of the alpha-2 macroglobulin and lipoprotein (a) in patients with childhood nephrotic syndrome
HANDAN AYDINGÜLÜ (BAYRAM)
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
1998
BiyokimyaÇukurova ÜniversitesiBiyokimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NURTEN DİKMEN
- Alfa-1 proteaz inhibitorlerine yönelik antikor üretimi ve iki farklı immünoassay ortamında alfa-1 proteaz inhibitörünün düzeyinin belirlenmesinde kullanımı
Production of antibody against alpha-1 proteinose inhibitor and using for determination level of alpha-1 proteinose inhibitor in two different immunoassay medium
OYA ORTAPAMUK ÖZDEMİR