Alfa-1 proteaz inhibitorlerine yönelik antikor üretimi ve iki farklı immünoassay ortamında alfa-1 proteaz inhibitörünün düzeyinin belirlenmesinde kullanımı
Production of antibody against alpha-1 proteinose inhibitor and using for determination level of alpha-1 proteinose inhibitor in two different immunoassay medium
- Tez No: 80919
- Danışmanlar: PROF. DR. NİLGÜN SÜMER
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyokimya, Biochemistry
- Anahtar Kelimeler: Alfa-1 proteaz inhibitörü, immünolojik teknikler, streptavidin peroksidaz, biyotin, horseradish peroksidaz, Alfa 1-antitripsin, Antikorlar, İmmünoassay, Alpha- 1 proteinase inhibitor, enzymeimmunoassay, strepteavidine peroxidase, biotin, horseradish peroxidase. vi, Alpha 1 antitrypsin, Antibodies, Immunoassay
- Yıl: 1999
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Hacettepe Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyokimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
ÖZET Bu çalışmada insan plazmasından saflaştınlan a-1 PFne yönelik antikor (poliklonal) üretimi amacı ile; inhibitörün Freund adjuvanlan ile hazırlanan emülsiyonlan tavşanlara (yaklaşık 3 kg ağırlığında, 5 adet erkek tavşan) belirli doz ve zaman aralıklarında i. m olarak enjekte edildi. Altıncı enjeksiyonu takiben 4 nolu tavşandan alınan antiserum iki farklı EIA sistemi ile incelendi. Bu amaçla önce her iki EIA sisteminde de belirteç enzim olarak kullanılan HRPO aktivitesinin incelenmesinde uygun substrat derişimi ([H2O2] = 0.5 mM) belirlendi. Katı faz avidin-biyotin indirekt ELISA'de mikrotitrasyon plakları anti-tavşan-keçi-Ig G'si (Abı) ile kaplandı. İkinci antikor (Ab2) olarak tavşan antiserumu, işaretli antijen olarak biyotinillenmiş a-1 PI (a- 1 PI*) ve belirteç enzim olarak streptavidin peroksidaz kullanılarak antijeni belirgin bir şekilde bağlayan en düşük antiserum dilüsyonu (titre) 1/600.000 olarak belirlendi. Standart eğri sabit miktarda antiserum (1/600.000) ve yine sabit miktarda a-1 PI* (78.15 ng/kuyu) varlığında ortama artan miktarlarda saf a-1 PI (0-300 ng/kuyu) eklenmesiyle enzim aktivitesinde lineer bir düşüşün gözlendiği aralıkta çizildi (0-3 ng/kuyu a-1 PI). Kompetitif ELISA sisteminde ise mikrotitrasyon plakları saf a-1 PI ile kaplandı. Abı olarak antiserumun ön denemelerle belirlenen 1/1000'lik dilüsyonu, Ab2 olarak da anti-tavşan HRPO kullanıldı. Bu yöntem ile yapılan standart çalışmalarında sabit miktarda Abı (1/1000) ile artan miktarlarda (0-900 ng/kuyu) saf a- 1 PI ön inkübasyona tabi tutuldu. Ön inkübasyon sonrası zeminde bağlı a-1 PI ile bağlanabilecek Abı miktarındaki azalma enzim aktivitesi üzerinden izlendi. Standart eğri enzim aktivitesinde lineer bir düşüşün gözlendiği aralıkta (0-900 ng/kuyu) çizildi. Antiserumun insan serum albumini (HSA) ve plazma proteaz inhibitörlerinden alfa-2- makroglobulin (a-2-M) ile olası çapraz reaksiyonunun incelenmesinde, HSA ile yaklaşık % 20 oranında çapraz reaksiyon olduğu saptandı. Antiserumun iki farklı EIA sisteminde incelendiği bu çalışmada, katı faz avidin- biyotin indirekt ELISA sisteminin kompetitif ELISA' den daha duyarlı olduğu görüldü. iv
Özet (Çeviri)
ABSTRACT In this study in order to produce antibody (polyclonally) against a-1 PI purified from human plasma, the emulsions of the inhibitor prepared with Freund's adjuvants were administered to the rabbits (about 3 kg, 5 male rabbits) intramuscularly in defined dose and time intervals. Following 6th injection the antisera obtained from the rabbit no 4 was investigated by two different EIA systems. Primarily appropriate substrat concentration ([H202]) for the measurement of the activity of HRPO that was used as the marker enzyme in both EIA's, was determined as 0.5 mM. In solid phase avidine-biotin indirect ELISA microliter plates were coated with anti-rabbit-goat Ig G (Abı). The lowest antisera dilution to bind significantly to antigen (titre) was determined as 1/600.000 by using antisera as the second antibody, biotinilated a-1 PI as the labelled antigen (a-1 PI*) and strepteavidine peroxidase the marker enzyme. The standart curve was obtained in the range between 0-3 pg a-1 Pl/well that gives a lineer decrease in enzyme avcitivty caused by addition of increasing amounts of purified a-1 PI (0-300 ng/well) in the presence of constant amounts of antisera (1/600.000) and a-1 PI* (78.15 ng/well). In competitive ELISA microtiter plates were coated with purified a-1 PI. The predetermined antisera dilution and antirabbit HRPO were used as Abı and Ab2 respectively. In standart assays by using this technique constant amount Abı preincubated with increasing amounts (0-900 ng/well) of purified a-1 PI. After preincubation the amount of free Abı which is available to bind to the a-1 PI coated wells was assessed by the changes in enzyme activity. The standart curve has been obtained in the range between 0-900 ng a-1 Pi/well in which the linear decrease had been observed in the enzyme activity. In the investigation of the probable cross reactivity between antisera and HSA or a2M 20 % cross reactivity was observed with HSA. The results of this study suggests that the solid-phase indirect ELISA system is more sensitive than competitive ELISA
Benzer Tezler
- Pulmonary amfizem ve karaciğer hastalığı ile ilgili seyrek görülen kalıtsal alfa 1 proteinaz inhibitör eksikliğinin moleküler temeli
The Molecular basis of the rare human genetic disorder alpha 1 proteinase inhibitor deficiency associated with pulmonary emphysema and liver disease
SHAHLA PARVİNGHODS
Doktora
Türkçe
1997
BiyokimyaHacettepe ÜniversitesiBiyokimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. İNCİ ÖZER
PROF. DR. JERRY L. BROWN
- Alfa-1 proteaz inhibitorünün elektroforetik analizinde görülen satelit bandın tanımlanması
The Identification of the satellite band that is seen in the electrophoretic analysis of alpha-1 protease inhibitor
HATİCE DİLSİZ
Yüksek Lisans
Türkçe
1999
BiyokimyaHacettepe ÜniversitesiBiyokimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NİLGÜN SÜMER
- Amfizemde alfa-1-proteaz inhibitörünün kapasitesinin incelenmesi
Investigation of alpha-1-protease inhibitory capacity in emphys
ZUHAL ADLI
- Alfa-1-proteinaz inhibitöründe fluoresan türevlendirme çalışmaları
Fluorescent derivatization of alfa-1-proteinase inhibitor
AYSES KURALAY
- Alfa-2-makroglobulin saflaştırılması; proteinaz varlığında alfa-2-makroglobulinin diğer inhibitörlerle interaksiyonunun incelenmesi
Purification of alpha-2-macroglobulin, investigation of the interaction of alpha-2-M with the other inhibitors in the presence of proteinase
OYA ORTAPAMUK