Cloning, expression and purification of recombinant elongation factor tu from hyperthermophilic bacteria geobacillus anatolicus
Hipertermofilik geobacillus anatolicus bakterilerinden rekombinant elongasyon faktörü tu'nun klonlanması, ekspresyonu ve saflaştırılması
- Tez No: 181199
- Danışmanlar: PROF. DR. NEŞE BİLGİN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2006
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Boğaziçi Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Bu çalışmada, Geobacillus anatolicus elongasyon faktörü Tu klonlanmış,Escherichia coli'de ekspresyonu yapılmış ve His-kuyruklu bir rekombinant protein olaraksaflaştırılmıştır. lk olarak, Geobacillus anatolicus tuf geninin dizisi belirlenmiştir.Geobacillus anatolicus tuf geninin dizisinin belirlenmesi için, Geobacillus anatolicus'afilogenetik olarak yakın bakterilerin tuf geni ve tuf geninin etrafındaki genler içinbelirlenmiş dizi bilgileri kullanılarak uygun oligonukleotit primerler tasarlanmıştır ve buoligonükleotit primerler kullanılarak tuf genini taşıyan kromozomal bölge çoğaltılmıştır.Elde edilen dizi bilgisi daha sonra tuf geninin uygun bir ekspresyon vektörüne klonlanmasıiçin kullanılmıştır. Rekombinant proteinin daha sonra Ni-afinite kromatografisi ilesaflaştırılabilmesi için vektör üzerinde klonlanan proteinin C-terminal bölgesine 6 Hisaminoasidi eklenmiştir. Bu vektör aracılığı ile Geobacillus anatolicus EF-Tu'sununEscherichia coli içinde yüksek miktarda ekspresyonu sağlanmış ve Ni-afinitekromatografisi kullanılarak saflaştırılmıştır . Geobacillus anatolicus'tan elde edilen EF-Tu'nun Geobacillus anatolicus EF-Ts proteini ile etkileşime girebildiği gösterilmiştir.Geobacillus anatolicus EF-Tu'su, Escherichia coli EF-Tu'suna göre denatüre etmeyenpoliakrilamid elekroforezinde anlamlı derecede hızlı bir ilerleme hızına sahiptir.Geobacillus anatolicus EF-Tu.EF-Ts bileşiği ile Geobacillus anatolicus EF-Ts'sinindenatüre etmeyen poliakrilamid elektroforezinde aynı ilerleme hızına sahip olması,bileşiğin oluşması sırasında EF-Tu proteininin önemli yapısal değişime uğradığına işaretetmektedir. Rekombinant Geobacillus anatolicus EF-Tu'sunun GTP ve Phe-tRNAPhe ileüçlü bileşik oluşturabildiği de yine denatüre etmeyen poliakrilamid elektroforezi ilegösterilmiştir. Geobacillus anatolicus EF-Tu'su 60ºC'de 10 dakika inkübe edildiğindeGDP bağlama aktivitesini korumaktadır. Bu değer 80ºC'de yaklaşık olarak %20'yeinmektedir.
Özet (Çeviri)
In this study, elongation factor Tu (EF-Tu) from Geobacillus anatolicus was cloned,expressed and purifed as a His-tagged recombinant protein in Escherichia coli. At first, thenucleic acid sequence of Geobacillus anatolicus tuf gene was determined by usingsequence data obtained from the bacteria phylogenetically related to Geobacillusanatolicus. The tuf gene and its neighbouring genes of the tuf gene sequences were used todesign appropriate oligonucleotide primers and these primers were used to amplify thechromosomal region carrying the tuf gene of Geobacillus anatolicus. The sequenceinformation from this fragment was then used to design primers to sequence and clone thecomplete tuf gene into an appropriate expression vector. This vector was used to expressand purify the protein in high quantities in Escherichia coli. Six additional histidineresidues were inserted into the recombinant protein of Geobacillus anatolicus at its C-terminal region to purify the protein using Ni-affinity chromotography to homogeneity. Itwas found that recombinant Geobacillus anatolicus EF-Tu is fully competent in forming abinary complex with Geobacillus anatolicus EF-Ts. It was determined that it has asignificantly higher mobility rate in non-denaturing PAGE as compared to Escherichiacoli EF-Tu, not explainable with molecular mass difference between these proteins. Themobility of the Geobacillus anatolicus EF-Tu.EF-Ts complex does not differ from themobility of the Geobacillus anatolicus EF-Ts, indicating a large conformational change ofEF-Tu upon binding to EF-Ts. The recombinant Geobacillus anatolicus EF-Tu can form aternary complex with GTP and Phe-tRNAPhe. Geobacillus anatolicus retained its GDPbinding activity fully after incubation at 60ºC for 10 min, and it still has approximately%20 of its activity after incubating for 10 min at 80ºC.
Benzer Tezler
- Cloning, expression and purification of recombinant elongation factor ts from hyperthermophilic bacteria geobacillus anatolicus
Hipertermofilik geobacillus anatolicus bakterilerinden rekombinant elongasyon faktörü Ts'nin klonlanması, ekspresyonu ve saflaştırılması
TOROS ŞAHİN
Yüksek Lisans
İngilizce
2006
BiyomühendislikBoğaziçi ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NEŞE BİLGİN
- Cloning, expression and purification of the recombinant DNA polymerase I from the hyperthermophilic bacteria Geobacillus anatolicus
Hipertermofilik Geobacillus anatolicus bakterilerinde rekombinant DNA polimeraz I'in klonlanması, ekspresyonu ve saflaştırılması
MELİKE ÇAĞLAYAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2005
Tıbbi BiyolojiBoğaziçi ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. NEŞE BİLGİN
- Hepatit C virusunun“core”proteinin prokaryotik hücrede ifade ettirilip saflaştırılması
The expression and purification of hepatitis C virus core protein in prokaryotic cells
ERTAN ÇAKMAK
Yüksek Lisans
Türkçe
2007
MikrobiyolojiDokuz Eylül ÜniversitesiMikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF.DR. Y. HAKAN ABACIOĞLU
Y.DOÇ.DR. İ. MEHMET ALİ ÖKTEM
- Cloning of Taql endonuclease gene into E.coli and its expression
Taql endonükleaz geninin E.coli'ye klonlanması ve ekspresyonu
İZZET ENÜNLÜ
- Cloning of thermostable glucose isomerase of thermus thermophilus in escherichia coli
Thermus themophilus'ün ısıl kararlı glikoz izomerazının escherichia colı'ye klonlanması
BERNA SARIYAR