Cloning of thermostable glucose isomerase of thermus thermophilus in escherichia coli
Thermus themophilus'ün ısıl kararlı glikoz izomerazının escherichia colı'ye klonlanması
- Tez No: 65117
- Danışmanlar: PROF. DR. AMABLE HORTAÇSU
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Kimya Mühendisliği, Chemical Engineering
- Anahtar Kelimeler: Escherichia coli, Glükoz, Thermus thermophilus, İzomerazlar, Escherichia coli, Glucose, Thermus thermophilus, Isomerases
- Yıl: 1997
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Boğaziçi Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
VI ÖZET Glikozun fruktoza dönüşümünde katalizör olarak gerekli olan glikoz izomeraz, günümüzde en çok kullanılan enzimlerden biridir. Glikozun fruktoza dönüşümü tersinir bir tepkimedir ve yüksek sıcaklıklarda fruktoz eldesi yükselir. Dolayısıyla ısnkararlı glikoz izomeraz üretimine duyulan ilgi gittikçe artmaktadır. Glikoz izomeraz sitoplazmik bir enzimdir. Sitoplazmadan enzimin saflaştırması pahalı bir yöntemken, hücre dışı üretim maliyeti önemli ölçüde düşürmektedir. Bu çalışmada, genetik mühendisliği teknikleri kullanılarak E. coli'de ısılkararlı glikoz izomeraz üretimi ve saflaştırma işlemini kolaylaştırmak amacı ile bu enzimin periplazmada bir fiizyon proteini olarak sentezi gerçekleştirildi Çalışmanın ilk kısmında, Thermus thermophilus bakteri DNAsında glikoz izomerazı kodlayan gen daha önceden hazırlanmış rekombinant pPGI vektöründen saflaştırıldı ve enzimin hücre içi üretimi için pUC18 vektörüne klonlandı. Escherichia coli DH5a susu bu rekombinant vektörle transforme edildikten sonra, değişik yöntemlerle yapılan tarama sonucu iki rekombinant koloninin sitoplazmasmda enzim aktivitesi belirlendi Bu rekombinantlardan biri için en verimli indüklenme süresi 8 saat ve zamanı geç eksponensiyal evresi (600 nm dalga boyunda optik yoğunluk 1.0 olduğu zaman) olarak belirlendi Çalışmanın ikinci kısmında, PCR yöntemi kullanılarak Thermus thermophilus bakteri DNAsındaki glikoz izomerazı kodlayan gen dizisi özel olarak tasarlanmış "primer'ler kullanılarak çoğaltıldı ve maltoza bağlanan protein (MBP) kodlayan mal£ genini taşıyan pMAL-p2 vektörüne klonlandı. Bu rekombinant vektör Escherichia coli TBI susuna transforme edildikten sonra, çeşidi yöntemlerle yapılan tarama sonucu beş rekombinant koloni belirlendi Seçilen kolonilerin periplazmalarındaki glikoz izomeraz aktivitesi genin başardı bir şekilde klonlandığını gösterdi
Özet (Çeviri)
ABSTRACT Glucose isomerase is one of the widely used commercial enzymes today. It catalyzes the isomerization reaction of glucose to fructose. This conversion is reversible and a higher temperature gives higher fructose contents. Hence there is continuing interest in thermostable glucose isomerases. Glucose isomerase is almost exclusively an intracellular enzyme. In the present study, genetic engineering techniques were used to produce thermostable glucose isomerase in E.coli cells. Purification of the enzyme from the cytoplasm requires costly processes, however extracellular production reduces these costs considerably. Therefore, the production of a fusion protein in the periplasm was considered as an important step to facilitate the downstream processing. In the first part of the study, the gene encoding glucose isomerase from the thermophile Thermus thermopMus was isolated from a previously constructed recombinant, pPGI and cloned into pUC18 vector for the intracellular production of the enzyme. After Escherichia coli DH5a strain was transformed with the recombinant construct, two correct recombinants with cytoplasmic activity of the expressions were identified by using different screening tests. Optimum induction time and period were determined for one of these constructs. The best time of induction was found to be late exponential phase and induction period of 8 hours was the optimum. In the second part of the study, the glucose isomerase gene from the thermophile Thermus thermophilic was amplified using specifically designed primers by PCR and was cloned into pMAL-p2 vector downstream from the malE gene which encodes a maltose binding protein (MBP). After Escherichia coli TBI strain was transformed with this recombinant construct, five correct recombinants were identified by using different screening tests. The presence of the glucose isomerase activity in the periplasmic space of the selected colonies indicated the successful cloning and expression of the corresponding gene.
Benzer Tezler
- İsolation of a thermostable glucose isomerase gene and its cloning for secretion in escherichia coli
Temostabil bir glikoz izomeraz geninin izolasyonu ve escherichia coli'de salgılama için klonlaması
PINAR ÖZKAN
Yüksek Lisans
İngilizce
1995
Kimya MühendisliğiBoğaziçi ÜniversitesiPROF.DR. AMABLE HORTAÇSU
PROF.DR. ASLIHAN TOLUN
- Clonind and purification of a thermostable DNA polymerase
Isılkararlı bir DNA polimeraz enziminin klonlanması ve saflaştırılması
EBRU TOKSOY
Yüksek Lisans
İngilizce
1995
Kimya MühendisliğiBoğaziçi ÜniversitesiPROF.DR. BETÜL KIRDAR
PROF.DR. ZEYNEP İLSEN ÖNSAN
- Cloning and expression of TaqI restriction endonuclease gene using pmal-c2 vector system in different straints of escherichia coli
TaqI restriksiyon endonükleaz geninin pmal-c2 vektör sistemi kullanılarak değişik escherichia coli suşlarında klonlanması ve ekspresyonu
ELİF ÖZKIRIMLI
Yüksek Lisans
İngilizce
1998
Kimya MühendisliğiBoğaziçi ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF.DR. BETÜL KIRDAR
- Cloning of Taql endonuclease gene into E.coli and its expression
Taql endonükleaz geninin E.coli'ye klonlanması ve ekspresyonu
İZZET ENÜNLÜ
- Cloning of TaqI endonuclease gene into E.coli and isolation of the enzyme by using pMAL-p2 vector system
pMAL-p2 vektör sistemi kullanılarak TaqI restriksiyon enzim geninin E.coli'ye klonlanması ve enzimin izolasyonu
PEMBE HANDE ÖZDİNLER