Geri Dön

Clonind and purification of a thermostable DNA polymerase

Isılkararlı bir DNA polimeraz enziminin klonlanması ve saflaştırılması

  1. Tez No: 47443
  2. Yazar: EBRU TOKSOY
  3. Danışmanlar: PROF.DR. BETÜL KIRDAR, PROF.DR. ZEYNEP İLSEN ÖNSAN
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Kimya Mühendisliği, Chemical Engineering
  6. Anahtar Kelimeler: Enzimler, Genler, Klonlama, Polimeraz zincirleme reaksiyonu, Thermus aquaticus, Enzymes, Genes, Cloning, Polymerase chain reaction, Thermus aquaticus
  7. Yıl: 1995
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Boğaziçi Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

ÖZET Polimeraz zincir reaksiyon ( PCR ) teknolojisinin moleküler biyoloji ve genetik alanında sık olarak uygulanması, Thermus aquaticus 'dan elde, edilen ısılkararlı Taq DNA Polimeraz enziminin çok miktarda kullanımını gerektirmiştir. Bu nedenle Taq DNA Polimeraz enzimi için hızlı ve verimli saflaştırma tekniklerinin geliştirilmesi biyoteknolojik uygulamalar bakımından son derece önem kazanmıştır. Bu çalışmanın ilk bölümünde, Taq DNA Polimeraz enzimi için küçük ölçekli bir saflaştırma yöntemi geliştirildi. Saflaştırma yönteminde daha önce tanımlanan metodlar değiştirilerek iyileştirildi ve laboratuar koşullarına uygun hale getirildi. Geliştirilen yöntemde Taq DNA Polimeraz genini taşıyan yüksek verimli bir plazmid içeren bir Escherichia co// susu kullanıldı. 1.3 g hücreden elde edilen Taq DNA Polimeraz enziminin özgün etkinliği 10309 ünite/mg olarak belirlendi. Çalışmanın ikinci bölümünde, tek aşamalı bir saflaştırma yöntemi geliştirmek için Taq DNA Polimeraz geni maltoza bağlanan protein (MBP) kodlayan mal E genini taşıyan bir vektöre ( pMAL-2 ) klonlandı. Bunun için bir çift primer tasarımlandı ve enzimin ilk iki amino asidi genetik olarak değiştirildi. Tarama sonucunda dört tane rekombinant bulundu. Kodlanan proteinler amiloz afinite kromatografi yöntemi ile ayrıştırıldı ve Faktör Xa enzimi ile kesildi. pP15 rekombinant plasmidini içeren hücrelerin özütünde aktif Taq DNA Polimeraz enzimine rastlanması, enzimi kodlayan genin başarılı bir şekilde klonlanmış olduğunu gösterdi.

Özet (Çeviri)

IV ABSTRACT The extensive use of the PCR technique in many applications of molecular biology and genetics results in the consumption of large amounts of Taq DNA Polymerase, the thermostable DNA Polymerase of Thermus aquaticus. Therefore, development of rapid and efficient purification techniques for this enzyme is very important. In the first part of this study, a small scale purification procedure was developed by modifying, improving and adapting the techniques available in the literature and applied to a genetically modified Eschericia coli strain containing an overproducing plasmid. A recovery of 10309 units/mg of Taq DNA Polymerase was achieved from 1.3 g cells. In the second part, in order to develop a single step purification procedure, the gene encoding the enzyme was cloned into pMAL-2 vectors downstream from the maE. gene of E.coli which encodes maltose-binding protein ( MBP ). For this purpose, a set of primers, flanking the 2500 base pair gene, was designed to create Xmn I and Bgl II sites at the two ends of the gene and the first two amino acids of the enzyme were genetically modified. Four correct recombinant constructions were identified from the screening tests. The expressed proteins were purified by affinity chromatography on cross-linked amylose and the eluates were hydrolyzed by Factor Xa protease. The presence of an active Taq DNA Polymerase in cell extracts of recombinant pP15 has indicated the successful cloning of the corresponding gene.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    76483

    Cloning and expression of TaqI restriction endonuclease gene using pmal-c2 vector system in different straints of escherichia coli

    TaqI restriksiyon endonükleaz geninin pmal-c2 vektör sistemi kullanılarak değişik escherichia coli suşlarında klonlanması ve ekspresyonu

    ELİF ÖZKIRIMLI

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    1998

    Kimya MühendisliğiBoğaziçi Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF.DR. BETÜL KIRDAR

  2. Tez No

    65117

    Cloning of thermostable glucose isomerase of thermus thermophilus in escherichia coli

    Thermus themophilus'ün ısıl kararlı glikoz izomerazının escherichia colı'ye klonlanması

    BERNA SARIYAR

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    1997

    Kimya MühendisliğiBoğaziçi Üniversitesi

    PROF. DR. AMABLE HORTAÇSU

  3. Tez No

    50457

    Cloning of Taql endonuclease gene into E.coli and its expression

    Taql endonükleaz geninin E.coli'ye klonlanması ve ekspresyonu

    İZZET ENÜNLÜ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    1996

    BiyolojiBoğaziçi Üniversitesi

    PROF.DR. BETÜL KIRDAR

  4. Tez No

    79310

    Expression and purification of the hepatitis c virus core protein in e.coli and testing of human sera with this core antigen

    Hepatit C virüsü core proteininin e.colide expresyonu ve saflaştırması ve insan serumunun bu antigan ile test edilmesi

    ÇAĞLA EROĞLU

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    1998

    Biyolojiİhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DR. ERGÜN PINARBAŞI

  5. Tez No

    50542

    Cloning of TaqI endonuclease gene into E.coli and isolation of the enzyme by using pMAL-p2 vector system

    pMAL-p2 vektör sistemi kullanılarak TaqI restriksiyon enzim geninin E.coli'ye klonlanması ve enzimin izolasyonu

    PEMBE HANDE ÖZDİNLER

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    1996

    BiyolojiBoğaziçi Üniversitesi

    PROF.DR. BETÜL KIRDAR

Geri Dön