Geri Dön

Gardnerella vaginalis'e etkili bakteriyofaj izolasyonu ve karakterizasyonu

Isolation and characterization of bacteriophage effective on Gardnerella vaginalis

PDF İndir

  1. Tez No: 971511
  2. Yazar: RÜMEYSA GÜLSU ÖZKAN
  3. Danışmanlar: PROF. DR. GAMZE BAŞBÜLBÜL
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Mikrobiyoloji, Biyoteknoloji, Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji, Microbiology, Biotechnology, Infectious Diseases and Clinical Microbiology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2025
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Aydın Adnan Menderes Üniversitesi
  10. Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

Amaç: Bu çalışma, kadınların yaklaşık %50'sini etkileyen ve antibiyotik tedavisine rağmen yüksek nüks oranlarıyla seyreden bakteriyel vajinoz (BV) enfeksiyonuna alternatif bir tedavi yaklaşımı geliştirmeyi amaçlamaktadır. Bu doğrultuda, BV'nin başlıca etkeni olan Gardnerella vaginalis'e karşı etkili bakteriyofaj tespiti ve moleküler düzeyde karakterize edilmesi hedeflenmiştir. Gereç ve Yöntem: Araştırma, Aydın Adnan Menderes Üniversitesi Araştırma Hastanesi Jinekoloji biriminden toplanan vajinal örneklerle gerçekleştirilmiştir. Vajinal örnekler Nugent skorlaması yapılarak hasta (BV'li) ve sağlıklı gruba kategorize edilmiş, G. vaginalis'in izolasyonu için hasta örnekleri kullanılmıştır. G. vaginalis'in fenotipik identifikasyonunda %5 insan kanı içeren Gardnerella için seçici besi ortamları kullanılmıştır. Morfolojisi G. vaginalis'e benzeyen ve beta hemoliz gösteren izolatlar mikroskobik olarak incelenmiştir. İzolatların moleküler identifikasyonu G. vaginalis'e spesifik primerler kullanılarak yapılmıştır. G. vaginalis'e etkili bakteriyofaj izolasyonu için vajinal hasta örnekleri kullanılmıştır. G. vaginalis üzerine etkili fajların taranması için spot test ve ikili agar kaplama yöntemi uygulanmıştır. Her iki yöntemde de faj varlığına işaret eden zon ve plak yapıları gözlemlenmiş olsa da, yeterli faj titresi elde edilemediği için klasik yöntemlerle faj DNA'sının izole edilmesi ve doğrudan karakterizasyonu mümkün olmamıştır. Bu sebeple, alternatif olarak, spot test ve ikili agar sonuçlarına göre pozitif olarak değerlendirilen hasta örneği kullanılarak doğrudan faj total DNA (Fajom) izolasyonu adımına geçilmiştir. Fajom DNA izolasyonu için uzun süreli santrifüj işleminin ardından Fenol/Kloroform yöntemi kullanılmıştır. İzole edilen total DNA'dan fajom analizi yeni nesil dizileme teknolojisi (NGS) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Biyoinformatik analiz Kbase otomatik işleme hattı ve RASTtk v1.073 anotasyon hattı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Elde edilen faj kontiğinin moleküler karakterizasyonu için genom üzerinde kodlanan ve G. vaginalis üzerine inhibitör etkisi olabilecek enzimler x araştırılmıştır. Faj endolizinin rekombinant eldesi için hedef gene özgü primerler tasarlanmış ve PCR amplifikasyonu gerçekleştirilmiştir. PCR amplifikasyonu sonrası pozitif olan gen ürünü klonlama amacıyla pet30a vektörüne aktarılmıştır. Ardından Escherichia coli BL21 suşuna transformasyonu gerçekleştirilmiştir. Transformasyon sonrası pozitif klonlar seçilerek protein ekspresyonu aşamasına geçilmiştir. Rekombinant proteinin saflaştırılması için IMAC (immobilize metal afinite kromatografi) yöntemi kullanılmıştır. Saflaştırılan rekombinant endolizinin enzimatik aktivitesi ve moleküler ağırlığı, sırasıyla zimogram analizi ve SDS PAGE yöntemi ile belirlenmiştir. Endolizinin G. vaginalis üzerine etkisi ise biyofilm önleme ve mevcut biyofilmi bozma deneyleri ile bakteri azaltma testi yapılarak belirlenmiştir. Bulgular: Çalışma kapsamında toplam 150 hastadan vajinal örnek toplanmıştır. Nugent analizi sonucunda 52 örneğin bakteriyel vajinoz (BV) ile uyumlu olduğu belirlenmiştir. Hasta örnekleri kullanılarak gerçekleştirilen izolasyon sonucunda beş izolatın G. vaginalis koloni morfolojisine benzer olduğu belirlenmiştir. İzolatların moleküler identifikasyonu ve sekans analizi sonucunda iki izolatın G. vaginalis'e ait olduğu doğrulanmıştır. Analiz sonucu ham veri setinin, ortalama uzunluğu 151 bps olan toplam 2,664,308,544 baz çiftine karşılık gelen 17,908,938 dizi içerdiği bulunmuştur. Diziler arasındaki bir kontik Gardnerella-ilişkili bir fajla %93 benzerlik göstermiştir. Çalışmaya bu faj kontiğiyle devam edilmiştir. Faj kodlu proteini rekombinant olarak üretmek ve saflaştırmak için genom üzerinde kodlanan faj proteini 1,4-beta-N acetylmuramidase seçilmiştir. Rekombinant enzim, rpLys olarak adlandırılmış ve enzimatik aktivitesi zimogram analizi ile gösterilerek, molekül ağırlığı 43 kDa olarak belirlenmiştir. rpLys'nin G. vaginalis biyofilmleri üzerine etkisinin araştırılmasında referans olması amacıyla S. aureus … ve E. coli .. suşları da kullanılmıştır. Üç farklı konsantrasyonda (75, 150 ve 300 µg/ml) denenen rpLys'in, biyofilm oluşumunu engelleme açısından S. aureus'da yaklaşık %70, E. coli'de yaklaşık %40 ve G. vaginalis'de %90 oranında etkili olduğu belirlenmiştir. Endolizinin olgun biyofilmleri bozma yeteneği ise, S. aureus'da yaklaşık % 40, E. coli'de % 10 ve G. vaginalis'de % 60 olarak belirlenmiştir. Endolizinin bakteri azaltma testi canlı bakteri sayımı yapılarak belirlenmiştir. Kontrol grubuna kıyasla rpLys endolizinin G. vaginalis'in büyümesini 16. saatten itibaren inhibe ettiği belirlenmiştir. Sonuç: Bu tez kapsamında BV tanısı almış hastalardan G.vaginalis suşları izole edilmiş ve tanılanmıştır. Rekombinant olarak üretilen ve saflaştırılan rpLys G. vaginalis üzerine inhibitör etki göstermiştir. Yapılan in vitro analizlerde bu proteinin G. vaginalis biyofilmlerini önleme ve olgun biyofilmleri parçalamada etkili olduğu gösterilmiştir. Ayrıca yapılan bakteri azaltma testinde, rpLys'in G. vaginalis'in büyümesi üzerine inhibisyon etkisi olduğu belirlenmiştir. Elde edilen bulgular, lizojenik fajların kodladığı endolizinlerin terapötik potansiyele sahip olabileceğini desteklemektedir. Özellikle BV tedavisinde kullanılabilecek antibiyotiklere alternatif, faj kökenli bir antimikrobiyal ajan karakterize edilmiştir.

Özet (Çeviri)

Objective: This study aims to develop an alternative therapeutic approach for bacterial vaginosis (BV), an infection that affects approximately 50% of women and is characterized by high recurrence rates despite antibiotic treatment. In this context, the study focused on the detection and molecular characterization of bacteriophages effective against Gardnerella vaginalis, the main causative agent of BV. Material and Methods: The study was conducted using vaginal samples collected from the Gynecology Unit of Aydın Adnan Menderes University Research Hospital. Vaginal samples were categorized into patient (BV-positive) and healthy groups based on Nugent scoring, and samples from the BV group were used for the isolation of G. vaginalis. For phenotypic identification of G. vaginalis, selective media containing 5% human blood were used. Isolates showing beta-hemolysis and morphology similar to G. vaginalis were examined microscopically. Molecular identification was performed using G. vaginalis-specific primers. For bacteriophage isolation, BV-positive vaginal samples were used. Spot tests and double layer agar methods were applied to screen for phages effective against G. vaginalis. Although inhibition zones and plaques indicative of phage presence were observed, classical methods failed to yield sufficient phage titers for DNA isolation and direct characterization. Therefore, as an alternative, total phage DNA (phagome) was isolated directly from the sample that tested positive in spot and plaque assays. After prolonged centrifugation, phenol/chloroform extraction was performed for DNA isolation. The isolated total phage DNA was analyzed using next-generation sequencing (NGS). Bioinformatic analyses were conducted using the KBase automated pipeline and RASTtk v1.073 annotation system. To characterize the phage contig, putative enzymes encoded by the phage genome with potential inhibitory effects on G. vaginalis were investigated. For recombinant production of the phage endolysin, primers specific to the target gene were designed, and PCR amplification was performed. The positive gene product xiii was cloned into the pET30a vector and transformed into Escherichia coli BL21 cells. Positive clones were selected for protein expression. Recombinant protein purification was carried out using immobilized metal affinity chromatography (IMAC). The enzymatic activity and molecular weight of the purified recombinant endolysin were determined with zymogram and SDS-PAGE analyses, respectively. The inhibitory effect of the recombinant endolysin (named rpLys) on G. vaginalis was evaluated using biofilm prevention and disruption assays, along with bacterial reduction tests. Results: A total of 150 vaginal samples were collected for this study. Nugent scoring showed that 52 samples were consistent with bacterial vaginosis (BV). Isolation from BV‑positive samples yielded five colonies with morphology typical of Gardnerella vaginalis; molecular identification and sequencing confirmed two of these isolates as G. vaginalis. High‑throughput sequencing of phage DNA produced 17,908,938 reads (average length 151 bp), amounting to 2,664,308,544 base pairs. Among the assembled contigs, one displayed 93 % similarity to a known Gardnerella‑associated phage and was chosen for further work. From this phage genome, the gene encoding 1,4‑β‑N‑acetylmuramidase was selected for recombinant expression. The enzyme, designated rpLys, showed lytic activity in zymogram assays and a molecular weight of 43 kDa by SDS‑PAGE. For reference, Staphylococcus aureus (…) and Escherichia coli (…) strains were included alongside G. vaginalis in biofilm assays. At three concentrations (75, 150, 300 µg ml⁻¹), rpLys inhibited biofilm formation by ~70 % in S. aureus, ~40 % in E. coli and ~90 % in G. vaginalis. For disruption of mature biofilms, rpLys achieved ~40 % reduction in S. aureus, ~10 % in E. coli and ~60 % in G. vaginalis. Viable‑count reduction tests further showed that rpLys began to inhibit G. vaginalis growth from the 16‑hour time point onward, compared with the control group. Conclusion: Within the scope of this thesis, G. vaginalis strains were isolated and identified from BV-diagnosed patients. The recombinant endolysin (rpLys), produced and purified in this study, demonstrated inhibitory effects on G. vaginalis. In vitro analyses showed that this protein is effective in both preventing G. vaginalis biofilm formation and disrupting established biofilms. In addition, bacterial reduction assays revealed that rpLys exerted an inhibitory effect on the growth of G. vaginalis. These findings support the therapeutic potential of endolysins encoded by lysogenic phages. A phage-derived antimicrobial agent with potential as an alternative to antibiotics in BV treatment was successfully characterized.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    870299

    Lactobacıllus crıspatus, lactobacıllus ıners, gardnerella vagınalıs, atopobıum vagınae ve candıda spp'nin gebelerde araştırılması

    Investigation of lactobacillus crispatus, lactobacillus iners,gardnerella vaginalis, atopobium vaginae, and candida spp. inpregnant women

    EZGİ GÖZÜN ŞAYLAN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    Mikrobiyolojiİstanbul Medipol Üniversitesi

    Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ ÖZLEM GÜVEN

  2. Tez No

    568285

    Tinidazol ve lidokainin yüksek performanslı sıvı kromatografisi yöntemi ile yanyana analizleri

    Simultaneous determination of tinidazole and lidocaine by high performance liquid chromatography

    DERYA GÖNÜLLÜ AYHAN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2019

    Eczacılık ve Farmakolojiİstanbul Üniversitesi

    Analitik Kimya Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. SERAP SAĞLIK ASLAN

  3. Tez No

    1021565

    Klinik sürüntü örneklerinde Human papillomavirus genotiplerinin diğer cinsel yolla bulaşan enfeksiyon etkenleri ile koenfeksiyonunun polimeraz zincir reaksiyonu yöntemi ile değerlendirilmesi

    Evaluation of Human papillomavirus genotypes and coinfection with other sexually transmitted pathogens in clinical swab samples using polymerase chain reaction

    SEMİHA BERRA TOPSAKAL KABA

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2026

    MikrobiyolojiSağlık Bilimleri Üniversitesi

    Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. YASEMİN COŞGUN

  4. Tez No

    959707

    Human papilloma virus pozitif bulunan hastalarda genotip dağılımı ve diğer cinsel yolla bulaşan mikroorganizmalar ile birlikteliğinin araştırılması

    Investigation of genotype distribution and association with other sexually transmitted microorganisms in human papilloma virus positive patients

    MUSTAFA ŞEN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2025

    Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik MikrobiyolojiBalıkesir Üniversitesi

    Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. GÜLHAN ÜNLÜ

  5. Tez No

    821363

    Antibacterial and antibiofilm effect of graphene oxide nanoparticles on Gardnerella vagіnalis isolated from Iraqi hospitals

    Irak hastanelerinden izole edilen Gardnerella vaginalis üzerinde grafen oksit nanopartiküllerinin antibakteriyel ve antibiofilm etkisi

    NOORA SABAH DAWOOD AAL-HASHIM

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2023

    BiyolojiÇankırı Karatekin Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ OKAN ÜRKER

Geri Dön