Koca engerek, Macrovipera lebetinus obtusa (dwigubsky, 1832) venomunun kimyasal profil ve biyolojik aktivite yönünden incelenmesi
Investigation of chemical profile and biological activities of blunt-nosed viper, Macrovipera lebetinus obtusa (dwigubsky, 1832) venom
- Tez No: 970514
- Danışmanlar: PROF. DR. EBRU GÜREL GÜREVİN, DR. ÖĞR. ÜYESİ HÜLYA TUBA KIYAN
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: Türkçe
- Üniversite: İstanbul Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Zooloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Yılan venomu, özel zehir bezlerinden salgılanan ve esas olarak protein ve peptitlerden oluşan bir karışımdır. Macrovipera lebetinus obtusa (MLO) venomu, terapötik potansiyeli olan biyolojik olarak aktif çeşitli proteinler/peptitler içerir. Bu çalışmada, Macrovipera lebetinus obtusa yılan venomunun ham hali ve Biyolojik Aktivite ile Yönlendirilmiş Fraksiyonlama (BAYF) yöntemi elde edilen etkili fraksiyonların (etil asetat, metanol ve su) antioksidan ve enzim (asetilkolinesteraz ve bütirilkolinesteraz) inhibitör özellikleri incelenmiş ve fraksiyonların proteomik bileşimini Sıvı Kromatografi-Tandem Kütle Spektrometrisi (LC-MS/MS) yöntemiyle araştırılmıştır. Sonuçlar, birçok peptit ve protein ailesini ortaya koymuş ve önemli biyolojik potansiyeli işaret etmiştir. Ham venomda sekiz aileye ait on dokuz benzersiz protein tanımlanmış, belirli fraksiyonlarda ise ilave proteinler saptanmıştır. Yılan venomlarında biyolojik olarak aktif temel bileşenler proteinler ve peptitler olup, su bazlı çözücülerde kolayca çözünürler ve kromatografiyle ayrıştırılabilirler. Ancak, bu çalışmada farklı polarite ve çözünürlük özelliklerine sahip protein dışı bileşenlerin de bu biyolojik aktivitelere katkı sağlayıp sağlamadığı araştırılmıştır. Bu amaçla, artan polariteye sahip çözücülerle ardışık fraksiyonlama gerçekleştirilmiştir. Macrovipera lebetinus obtusa venomu fraksiyonlarının enzim inhibitör aktiviteleri; redükleyici güç ölçümü, metal şelatlama, 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sülfonik asit (ABTS•+) radikal katyon renksizleştirme yöntemi ve 2.2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) serbest radikal süpürücü yöntemleri ile in vitro antioksidan aktiviteleri belirlenmiştir. M. lebetinus obtusa venomunun metanol fraksiyonu önemli düzeyde metal şelasyonu (%60,77 ± 0,1) göstermiş ve belirgin antioksidan aktivite sergilemiştir (EC50 = 281,3 µg/mL). Etil asetat fraksiyonu da redükleyici güç bakımından etkili olmuş ve EC50 değeri 263,2 µg/mL olarak ölçülmüştür. Ancak hiçbir fraksiyon ve ham venom, DPPH serbest radikal temizleme aktivitesi ve ABTS•+ radikal katyon dekolorizasyon testinde antioksidan aktivite göstermemiştir. Etil asetat fraksiyonu, asetilkolinesteraz (AChE) inhibitör aktivitesinde önemli bir etki (%75,39 ± 0,3) göstermiş ve bu etki, referans inhibitör donepezil (%98,60 ± 0,1) ile karşılaştırılabilir düzeyde bulunmuştur. Ancak bütirilkolinesteraz (BuChE) inhibitör aktivitesi daha düşük çıkmıştır (%20,65 ± 4,5). Bildiğimiz kadarıyla bu tez çalışması, MLO venom fraksiyonlarının antioksidan ve anti-kolinesteraz etkileri üzerine yapılan ilk çalışmadır. Etanol fraksiyonu çok güçlü asetilkolinesteraz (AChE) inhibitörü (75,39 ± 0,3), ancak orta düzeyde butirilkolinesteraz (BuChE) inhibitörü etkisi, metanol fraksiyonu ise düşük AChE inhibitörü (54,65 ± 0,2) etkisi göstermiş ve MLO zehir fraksiyonlarının BuChE inhibitör aktivitesi göstermediği belirlenmiştir. Bu çalışma ayrıca, MLO ham venomunun etil asetat, etanol, metanol ve su fraksiyonlarının insan meme kanser hücre hatlarının (MDA-MB-231 ve MCF-7) ve normal epitel meme hücre hattının (MCF-12A) çoğalması üzerindeki etkilerini 3-(4,5-dimetil-2-tiyazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazolium bromür (MTT) testi kullanılarak araştırmaktadır. Farklı venom fraksiyonlarının (etil asetat, etanol, metanol ve su) etkileri 24, 48 ve 72 saat boyunca test edilmiştir. Uygulanan tüm fraksiyonlar MCF-7 hücrelerinin canlılığını doza ve zamana bağlı olarak azaltmıştır ve en fazla azalmanın su fraksiyonunda olduğu gözlenmiştir. MDA-MB-231 hücrelerinde ise metanol ve etanol fraksiyonları hücre canlılığında daha az azalmaya yol açarken, su fraksiyonunun hücre canlılığını en fazla azalttığı gözlenmiştir. MCF-12A hücrelerinde ise tüm fraksiyonlarda belirli doz ve sürelerde hücre canlılığının %50'nin altına düştüğü gözlenmiştir. En kuvvetli azalmanın yüksek konsantrasyondaki su fraksiyonlarının ve düşük konsantrasyondaki etil asetat ve metanol fraksiyonlarının uygulanması ile gerçekleştiği belirlenmiştir. Sülforodamin B (SRB) canlılık testi ile MLO ham venomunun çeşitli fraksiyonlarının MDA-MB-231, MCF-7 ve MCF-12A hücre hatları üzerindeki etkileri değerlendirilmiştir. Venom, 24, 48 ve 72 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda (1,25-25 μg/ml) test edilmiştir. SRB testi sonuçlarına göre, MDA-MB-231 ve MCF-7 hücrelerinde en belirgin azalma su fraksiyonunda gözlenmiştir. Diğer fraksiyonlar arasında MCF-7 hücrelerinin düşük konsantrasyonlardaki etil asetat ve metanol fraksiyonlarına duyarlı olduğu, MDA-MB-231 hücrelerinin ise etil asetat fraksiyonuna duyarlı olduğu belirlenmiştir. MCF-12A hücrelerinde ise etanol ve su fraksiyonlarının yüksek konsantrasyonlarda hücre canlılığını belirgin olarak azalttığı gözlenmiştir. Çalışmamızda, 5 μg/pellet ve 50 μg/mL konsantrasyonlarda, MLO ham venomunun (etanol, metanol ve su fraksiyonlarını içeren) anti-anjiyogenenik etkileri gösterilmiştir. Ham zehir, metanol ve su fraksiyonları, embriyonik gelişimin altıncı gününde agaroz peletler içinde kuluçkadaki civciv embriyolarına uygulanmıştır. Yumurtaların damar yoğunluğu, 24 saatlik inkübasyon süresi sonrasında değerlendirilmiştir. Etanol fraksiyonunda zararlı herhangi bir etki gözlemlenmemiştir. MLO venomu, MLO metanol ve su fraksiyonlarının uygulandığı kuluçkalık yumurtalarda, vasküler yoğunluğun kontrole ve standartlar Suramin, Hidrokortizon ve Talidomite göre önemli derecede inhibe edildiği saptanmıştır (p<0,001). CAM sonuçlarına göre kontrol (%2,5 agaroz) ve standartlara (Suramin, Hidrokortizon, Talidomit) ile karşılaştırıldığında 5 µg/pellet konsantrasyonda venom, metanol ve su fraksiyonları; Suramin ve Hidrokortizon'dan daha fazla, ancak Talidomit'ten daha az oranda ve belirgin bir şekilde kapiller damar gelişimini inhibe ederek, in vivo anti-anjiyogenik etki göstermiştir. Sonuçlar, Macrovipera lebetinus obtusa venomu ve fraksiyonlarının biyolojik olarak aktif kimyasallar açısından zengin olabileceğini ve protein dışı bileşenlerin de bu aktivitelerde rol oynayabileceğini göstermektedir.
Özet (Çeviri)
Snake venom is a complex mixture primarily composed of proteins and peptides, secreted from specialized venom glands. The venom of Macrovipera lebetinus obtusa (MLO) contains various biologically active proteins and peptides with therapeutic potential. In this study, the crude venom of Macrovipera lebetinus obtusa and its biologically active fractions—ethyl acetate, methanol, and water—obtained through Bioactivity-Guided Fractionation (BGF), were investigated for their antioxidant and enzyme inhibitory properties, specifically targeting acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase. Additionally, the proteomic composition of these fractions was analyzed using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS). The results revealed a wide array of peptides and protein families, highlighting significant biological potential. Nineteen unique proteins belonging to eight families were identified in the crude venom, with additional proteins detected in specific fractions. The main biologically active components in snake venoms are proteins and peptides, which are readily soluble in water-based solvents and can be separated using chromatography. However, this study also investigated whether non-protein components with different polarity and solubility characteristics contribute to these biological activities. To this end, sequential fractionation was performed using solvents of increasing polarity. The enzyme inhibitory activities of Macrovipera lebetinus obtusa venom fractions were evaluated, along with their in vitro antioxidant activities, using methods such as reducing power assay, metal chelation, 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS•⁺) radical cation decolorization assay, and 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging assay. The methanol fraction of Macrovipera lebetinus obtusa venom exhibited significant metal chelating activity (60.77% ± 0.1) and demonstrated notable antioxidant activity (EC₅₀ = 281.3 µg/mL). The ethyl acetate fraction also showed effective reducing power, with an EC₅₀ value of 263.2 µg/mL. However, neither the crude venom nor any of the fractions exhibited antioxidant activity in the DPPH free radical scavenging assay or the ABTS•⁺ radical cation decolorization test. The ethyl acetate fraction showed a significant effect in acetylcholinesterase (AChE) inhibitory activity (75.39% ± 0.3), which was comparable to the reference inhibitor donepezil (98.60% ± 0.1). However, its butyrylcholinesterase (BuChE) inhibitory activity was much lower (20.65% ± 4.5). To the best of our knowledge, this thesis represents the first study on the antioxidant and anticholinesterase effects of MLO venom fractions. The ethyl acetate fraction acted as a strong AChE inhibitor (75.39% ± 0.3) but showed only moderate BuChE inhibitory activity. In contrast, the methanol fraction exhibited a lower AChE inhibitory effect (54.65% ± 0.2), and no significant BuChE inhibition was observed in any of the MLO venom fractions. This study also investigates the effects of crude Macrovipera lebetinus obtusa (MLO) venom and its ethyl acetate, ethanol, methanol, and water fractions on the proliferation of human cancer cell lines (MDA-MB-231 and MCF-7) and a normal mammary epithelial cell line (MCF-12A) using the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay. The effects of the different venom fractions were evaluated over 24, 48, and 72 hours. All applied fractions reduced the viability of MCF-7 cells in a dose- and time-dependent manner, with the most pronounced reduction observed in the water fraction. In MDA-MB-231 cells, the methanol and ethanol fractions caused less reduction in cell viability, whereas the water fraction resulted in the greatest decrease. In MCF-12A cells, all fractions led to a drop in cell viability below 50% at certain concentrations and exposure times. The strongest reductions were observed with high concentrations of the water fraction and low concentrations of the ethyl acetate and methanol fractions. The Sulforhodamine B (SRB) viability assay was used to evaluate the effects of crude Macrovipera lebetinus obtusa (MLO) venom and its various fractions on MDA-MB-231, MCF-7, and MCF-12A cell lines. The venom was tested at different concentrations (1.25–25 μg/mL) over 24, 48, and 72 hours. According to the SRB assay results, the most pronounced decrease in cell viability for both MDA-MB-231 and MCF-7 cells was observed with the water fraction. Among the other fractions, MCF-7 cells were found to be sensitive to low concentrations of the ethyl acetate and methanol fractions, while MDA-MB-231 cells showed sensitivity to the ethyl acetate fraction. In MCF-12A cells, both the ethanol and water fractions significantly reduced cell viability at higher concentrations. In our study, the anti-angiogenic effects of crude Macrovipera lebetinus obtusa (MLO) venom -including its ethanol, methanol, and water fractions- were demonstrated at concentrations of 5 μg/pellet and 50 μg/mL No harmful effects were observed in the ethanol fraction. The crude venom, along with the methanol and water fractions, was applied to chick embryos on embryonic day six using agarose pellets. Vascular density was assessed after a 24-hour incubation period. The results showed that vascular density in eggs treated with crude MLO venom, methanol, and water fractions was significantly inhibited compared to both the control and standard anti-angiogenic agents—Suramin, Hydrocortisone, and Thalidomide (p<0.001). According to the chorioallantoic membrane (CAM) assay results, at a concentration of 5 µg/pellet, the venom, methanol, and water fractions exhibited a distinct in vivo anti-angiogenic effect by inhibiting capillary development more effectively than suramin and hydrocortisone, but less than thalidomide. These results suggest that Macrovipera lebetinus obtusa venom and its fractions may be rich in biologically active compounds and that non-protein components may also play a role in these activities.
Benzer Tezler
- Koca engerek, Macrovipera lebetina (Linnaeus, 1758)'nın Güneydoğu Anadolu ve Kıbrıs alt türlerinin zehirlerinin proteomik ve spektroskopik yöntemlerle karşılaştırılması
Venom comparisons of the two subspecies of blunt-nosed viper, Macrovipera lebetina (Linnaeus, 1758) from South-Eastern Anatolia and cyprus by proteomic and spectroscopic methods
NAŞİT İĞCİ
Yüksek Lisans
Türkçe
2010
BiyoteknolojiAnkara ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. FATMA DUYGU ÖZEL DEMİRALP
- Macrovipera lebetina obtusa (koca engerek) bireysel zehir varyasyonunun protein profili ve fosfolipaz A2 enzim aktivitesi açısından araştırılması
Investigation of the individual venom variation of Macrovipera lebetina obtusa (blunt-nosed viper) in terms of protein profile and phospholipase A2 enzyme activity
ŞEYMA EROĞLU
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
BiyolojiNevşehir Hacı Bektaş Veli ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ NAŞİT İĞCİ
- Anthemis tricolor Boiss. bitkisinin Macrovipera lebetina Obtusa venomu ile indüklenen enflamasyon üzerine anti-enflamatuvar etkisinin araştırılması
Evaluation of anti-inflammatory effect of Anthemis tricolor Boiss. against Macrovipera lebetina Obtusa venom induced inflammation
DİLARA AŞKIN
- Macrovipera lebetinus (Koca Engerek) Zehrinde Bireysel Varyasyonun L-Amino Asit Oksidaz, Hyaluronidaz ve Fosfodiesteraz Enzim Aktiviteleri Açısından Araştırılması
Investigation of the Individual Variation in Macrovipera lebetinus (Blunt-Nosed Viper) Venom in terms of L-Amino Acid Oxidase, Hyaluronidase and Phosphodiesterase Enzyme Activities
RABİA TAŞ
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
BiyoteknolojiNevşehir Hacı Bektaş Veli ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ NAŞİT İĞCİ
- Macrovipera lebetinus zehrinin insan kolorektal karsinom hücreleri üzerinde moleküler ve terapötik etkisinin araştırılması
Investigation of molecular and therapeutic effects of Macrovipera lebetinus venom on human colorectal carcinoma cells
SUDE KOCABIYIK
Yüksek Lisans
Türkçe
2025
BiyokimyaSelçuk ÜniversitesiBiyokimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. SERDAR KARAKURT