Geri Dön

Molecular characterization of a propolis-resistant saccharomyces cerevisiae strain obtained by inverse metabolic engineering

Tersine metabolik mühendislik yöntemiyle elde edilen propolis dirençli saccharomyces cerevisiae suşunun moleküler karakterizasyonu

PDF İndir

  1. Tez No: 935820
  2. Yazar: FİLİZ DEMİR YILMAZ
  3. Danışmanlar: PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Genetik, Biyoteknoloji, Genetics, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2025
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

Propolis, arıların bitkilerden topladıkları reçineleri kendi mumsu bileşikleriyle karıştırarak elde ettikleri reçineli, yapışkan ve koyu renkli bir bileşiktir. Ayrıca propolis, bal arıları tarafından kovanlarını inşa etmek ve onları funguslar ve bakterilere karşı korumak amacıyla kullanılır. Propolis kullanımı milattan önce 300 yıllarından başlayarak günümüzde de tamamlayıcı tıp ve ilaç geliştirme alanlarında devam etmektedir. Propolis, yapısında bulunan üçyüzden fazla bileşen ile karmaşık bir kimyasal içeriğe sahiptir. Bu bileşenler polifenoller, fenolik aldehitler, kumarinler, aminoasitler, steroid ve inorganik bileşenler olarak sıralanabilir. Propolis içeriği, hangi bölgede üretildiğine göre değişir. Sıcaklık ve mevsimsel etki gibi doğal faktörler propolis bileşimini etkiler. Propolis; antimikrobiyal aktivite, antitümör aktivitesi, antioksidant aktivite, antiinflamatuar aktivite, sitotoksik aktivite ve terapötik aktivite gibi biyolojik aktiviteler göstermektedir. Ayrıca propolis; süperoksit anyonu, hidroksil radikali ve peroksil radikali gibi serbest radikallere karşı güçlü radikal uzaklaştırma aktivitesine sahiptir. Bu aktivite hücre ve dokularda oksidatif hasarın önlenmesine yardımcı olur. Ayrıca, antibakteriyel ve antifungal özellikleri, tıp, tarım, kozmetik ve gıda sektörü dahil olmak üzere çeşitli alanlarda fayda sağlamasına olanak kazandırır. Propolis, başlangıç kültürü olarak Saccharomyces cerevisiae mayası kullanılan etanol fermantasyonunda, kontamine edici diğer mayaların üremesini önlemek amacıyla, alışılagelmiş stratejilerden farklı olarak da kullanılmaktadır. S. cerevisiae, ökaryotik bir maya olup fungus alemine aittir. Hücre yapısı yuvarlak ve hücre büyüklüğü 10 µm ile 5µm arasında değişmektedir. S. cerevisiae; hızlı büyümesi, erişilebilirliği, manipülasyona olan genetik yatkınlığı, fizyolojisi ve metabolizması sayesinde endüstriyel olarak önemli bir mikroorganizmadır. Ayrıca tek hücreli özellikleri ve hızlı üremesi, maliyeti azaltarak kullanılabilirliğini artırır. Genetik araştırmalar için de tercih edilen S. cerevisiae, genomu dizilenen ilk ökaryotik mikroorganizmadır. Mayanın genetik çalışmalardaki başarısı, genetik olarak manipüle edilebilme kolaylığından kaynaklanmaktadır. Bu nedenle S. cerevisiae, gen delesyonu, aşırı ekspresyonu ve/veya heterolog gen ekspresyonunu içeren birçok genetik çalışmada kullanılmaktadır. Genetik araştırmalardaki bu avantajları nedeniyle S. cerevisiae, insan gibi daha karmaşık organizmaların genetiğini incelemek için ökaryotik model organizma olarak da kullanılır. Evrimsel mühendislik bir tersine metabolik mühendislik stratejisi ve istenen fenotipi elde etmek için evrim prosedürlerinin sürekli uygulanmasıdır. Daha önce evrimsel mühendislik stratejisiyle propolise oldukça dirençli ve genetik olarak kararlı bir S. cerevisiae mutant suşu elde edilmiş ve FD11 olarak adlandırılan propolis dirençli suş ile fizyolojik analizler gerçekleştirilmişti. Referans suş 150 µg/mL propolis konsantrasyonunda önemli ölçüde inhibe olurken, mutant suş 710 µg/mL propolis konsantrasyonuna kadar direnç göstermiştir. Mutant suş FD11, propolis stresi altında referans suşa kıyasla daha yüksek bir büyüme oranı göstermiş ve aynı zamanda kafein stresine de çapraz direnç sergilemiştir. Ek olarak, FD11 propolis varlığında ve yokluğunda referans suşa kıyasla daha düşük düzeyde reaktif oksijen türleri içermiştir. Hücresel fonksiyonun tüm hücre seviyesinde daha iyi anlaşılması, fonksiyonel genomik ve metabolik mühendisliğin ortak amacıdır. Bu nedenle, omik analizlerin tersine metabolik mühendislik araştırmaları üzerinde büyük etkisi vardır. Bu tez çalışmasında, propolise dirençli bir S. cerevisiae suşu olan FD11'in moleküler mekanizmasınının genomik ve transkriptomik analizler ile aydınlatılması amaçlanmıştır. Transkriptomik analizler DNA mikrodizin teknolojisi ile, genomik analizler ise tüm genom dizilimi ile gerçekleştirilmiştir. Mikrodizin sonuçlarına göre 5092 genin anlatımı değişmiş, bu genlerden 2579 gende anlatım azalması, 2513 gende ise anlatım artması olmuştur. Analiz sonuçları, referans suşa göre propolis dirençli FD11'de (p <0.05) istatistiksel olarak en az iki kat ekspresyon değişikliği ile 182 Açık Okuma Çerçevesinin (ORF) anlatımının arttığı ve 239 Açık Okuma Çerçevesinin (ORF) nin ise anlatımının azaldığını göstermiştir. Gen ontoloji analizi ile anlatımı azalmış ve artmış gen gruplarının biyolojik önemi incelenmiştir. Karşılaştırmalı transkriptomik analiz sonuçları, oksidoredüktaz aktivitesi, transmembran taşıyıcı aktivitesi ve katlanmamış protein bağlanmasında rol oynayan genlerin anlatımının aşırı arttığını ortaya çıkarmıştır. Çeşitli pleiotropik ilaç direnci genlerinin de anlatımı artmıştır. FunCat analiz sonuçlarına göre, RNA bağlanması, mRNA bağlanması, metiltransferaz aktivitesi, rRNA bağlanması, transmembran taşıyıcı aktivitesi, helikaz aktivitesi, nükleotidiltransferaz aktivitesi ve DNA bağlanması gibi kategorilerde bulunan genlerin anlatımında ise en az iki kat azalma olmuştur. Yeni nesil dizileme (NGS) tekniği, milyonlarca DNA parçasının paralel olarak dizilenmesine olanak tanır ve bu bireysel okumaları referans genomla eşleştirmek için biyoinformatik yöntemler kullanılır. Propolise dirençli mutant suşun (FD11) genomik düzeyde taranması ve elde edilen suşta mevcut olan genetik varyansların belirlenmesi için tüm genomun yeniden dizilenmesi analizi uygulanmıştır. Tüm genom yeniden dizileme sonuçları, referans suş mutasyonlarıyla karşılaştırıldığında FD11'de toplam 350 tek nükleotid varyasyonunun (TNV) bulunduğunu ortaya çıkardı. Bu varyasyonların çoğunluğu geçiş (transition) mutasyonlarıdır (236 adet), geri kalanı ise değişim (transversion) mutasyonlarıdır (114 adet). Mutant S. cerevisiae suşunda (FD11), 185 eş anlamlı olmayan ve 165 eşanlamlı mutasyon görülmüştür. Tüm genom yeniden dizileme analizi sonuçları, transkriptomik verilerle benzer olup PDR1 (Çok Yönlü İlaç Direnci 1) geninde tespit edilen mutasyonun, çoklu ilaca direnç genlerinin ekspresyon seviyelerindeki değişiklikler üzerinde potansiyel bir etkiye sahip olabileceği değerlendirilmiştir. Sonuçlar, propolis direncinde pleiotropik ilaç yanıtının önemini ve propolis dirençli, dayanıklı maya suşlarının endüstriyel uygulamalarda kullanılma potansiyelini ortaya koymaktadır. Bu çalışmada, literatürde ilk kez, propolise dirençli bir S. cerevisiae mutant suşu elde edilmiştir. Mutant suşun genomik ve transkriptomik analizleri, propolis direncinde mitokondriyal aktivitenin, pleiotropik ilaç direnci (PDR) genlerinin ve hücre duvarı bütünlüğünün önemini ortaya koymuştur.

Özet (Çeviri)

Propolis is a resinous, sticky and dark colored substance that bees produce by mixing their own waxes with resins obtained from plants. Propolis is also used as a building material and bees protect their hives through propolis against fungi and bacteria. Propolis has been used at least since 300 BC and its use goes on today in complementary medicine and drug development. The chemical composition of propolis is quite complex, as more than 300 compounds, such as polyphenols, phenolic aldehydes, sesquiterpene quinines, coumarins, amino acids, steroids, and inorganic compounds have been identified in propolis samples. Propolis has a wide range of important biological activities, such as antioxidant, antibacterial, antiviral, antifungal, anti-inflammatory, and anticancer activities. Propolis has strong radical scavenging activity against free radicals such as superoxide anion, hydroxyl radical, and peroxyl radical. This activity helps prevent cells and tissues from oxidative damage. Also, its antibacterial and antifungal qualities make propolis useful in a variety of fields, including medicine, agriculture, cosmetics, and the food sector. The use of propolis was suggested to control the growth of contaminating yeast in ethanol fermentations, without significantly affecting the starter yeast of fermentation, Saccharomyces cerevisiae, as a nonconventional strategy. S. cerevisiae is a eukaryotic organism, also named as baker's yeast or budding yeast. S. cerevisiae cells are mainly oval-shaped, but cell size varies between 10 µm long and 5 µm wide, according to environmental conditions. S. cerevisiae is an industrially important microorganism because of its rapid growth, abundance, genetic flexibility to manipulation, physiology and metabolism. Also, single cell properties and rapid doubling time of S. cerevisiae promote its cost-effectiveness and usability. S. cerevisiae is also preferred for genetic research, and it is the first eukaryote the genome of which was sequenced. Success of yeast in genetic studies is originated from the ease with which it can be genetically manipulated. Therefore, S. cerevisiae is used in many genetic studies that involve gene deletion, overexpression and/or heterologous gene expression. Because of these advantages in genetic research, S. cerevisiae is also used as a eukaryotic model organism to study the genetics of more complex organisms like human. Evolutionary engineering is an inverse metabolic engineering strategy that involves the application of continuous evolution procedures to obtain a desired phenotype. A highly propolis-resistant and genetically stable S. cerevisiae mutant was previously obtained by evolutionary engineering strategy and physiological analyses were performed with the evolved strain called FD11 in a previous study. The reference strain was significantly inhibited at propolis concentrations more than 150 µg/mL, but the evolved strain could withstand up to 710 µg/mL propolis. The evolved strain FD11 had a higher growth rate than the reference strain under propolis stress and showed cross-resistance against caffeine stress. Additionally, it had significantly lower reactive oxygen species levels than the reference strain, both in the presence and absence of propolis stress. Improved understanding of the cellular function at the whole cell level is the common aim of functional genomics and metabolic engineering. Hence, omic analysis has great impact on inverse metabolic engineering research. The aim of this thesis study was to elucidate the molecular mechanism of the propolis-resistant S. cerevisiae strain, FD11, using genomic and transcriptomic analyses. The transcriptomic analyses were applied using DNA microarray technology, and genomic analyses were performed using whole genome sequencing. According to microarray results, 5092 genes were affected, 2579 genes of these were downregulated and 2513 genes were upregulated. The analysis results showed that, among genes by at least two-fold expression change, 182 Open Reading Frames (ORFs) were upregulated and 239 ORFs were downregulated in the propolis-resistant FD11 (corrected p < 0.05), relative to the reference strain. Comparative transcriptomic analysis results revealed that the genes involved in oxidoreductase activity, transmembrane transporter activity and unfolded protein binding were overexpressed. Various pleiotropic drug resistance genes were also upregulated. According to FunCat analysis results, at least two-fold downregulated genes were mainly enriched in“Protein Synthesis/Cell Cycle and DNA Processing/Transcription”category, including RNA binding, mRNA binding, methyltransferase activity, rRNA binding, transmembrane transporter activity, helicase activity, nucleotidyltransferase activity and DNA binding. Whole genome re-sequencing results revealed that totally 350 single nucleotide polymorphisms (SNPs) were found in FD11, compared to the reference strain, after alignment. Most of the SNPs were transition substitutions (236), and the remaining were transversion substitutions (114), the typical mutation type observed in EMS mutagenesis. The evolved strain had 185 nonsynonymous and 165 synonymous mutations. Whole genome re-sequencing analysis results were in line with transcriptomic results, which identified a mutation in the PDR1 gene which may have a potential impact on changes in the expression levels of multidrug resistance genes. Mutations were found in several genes, including PDR1, which codes for a transcription factor that controls pleiotropic drug response, according to whole genome re-sequencing analysis. The results imply the importance of pleiotropic drug response in propolis resistance and the potential of using propolis-resistant, robust yeast strains in industrial applications. In this study, a propolis-resistant S. cerevisiae mutant strain has been obtained for the first time in the literature. Genomic and transcriptomic analyses of the evolved strain revealed the importance of mitochondrial activity, pleiotropic drug resistance (PDR) genes, and cell wall integrity in propolis resistance. The findings of this study, particularly at the physiological, genomic, and transcriptomic levels, may serve as a guide for further research to elucidate the multigenic and complex molecular mechanisms of propolis response and resistance in S. cerevisiae and higher eukaryotes.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    511290

    Evolutionary engineering and physiological analysis of antimycin-a resistant Saccharomyces cerevisiae

    Antimisin-a dirençli Saccharomyces cerevisiae'nin evrimsel mühendisliği ve fizyolojik analizi

    ALİCAN TOPALOĞLU

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2018

    Genetikİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

  2. Tez No

    625499

    Inverse metabolic engineering and molecular characterization of caffeine-resistant saccharomcyes cerevisiae

    Kafeine dirençli saccharomcyes cerevisiae'nin tersine metabolik mühendislik ile eldesi ve moleküler karakterizasyonu

    YUSUF SÜRMELİ

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2020

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

  3. Tez No

    1010315

    Molecular characterization of an antimycin a-resistant saccharomyces cerevisiae strain obtained by inverse metabolic engineering

    Tersine metabolik mühendislik ile elde edilmiş antimisin a-dirençli saccharomyces cerevisiae suşunun moleküler karakterizasyonu

    ALİCAN TOPALOĞLU

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2026

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

    DOÇ. DR. CECILIA GEIJER

  4. Tez No

    204

    Nükleer rezonasta moleküler yapıların incelenmesi (yapısal faz geçiş kuramları üzerine bir inceleme)

    Başlık çevirisi yok

    ABDURRAHMAN ANDİÇ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    1986

    Fizik ve Fizik MühendisliğiUludağ Üniversitesi

    Fizik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AYTAÇ YALÇINER

  5. Tez No

    228

    1,3-difenil-4,5-bis(hidroksiimino)-imidazolidin ve Ni(II), Cu(II), Pd(II), UO2(VI) komplekslerinin sentezi

    Başlık çevirisi yok

    VEFA AHSEN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    1984

    Kimya MühendisliğiUludağ Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ÖZER BEKAROĞLU

Geri Dön