Molecular characterization of an antimycin a-resistant saccharomyces cerevisiae strain obtained by inverse metabolic engineering
Tersine metabolik mühendislik ile elde edilmiş antimisin a-dirençli saccharomyces cerevisiae suşunun moleküler karakterizasyonu
- Tez No: 1010315
- Danışmanlar: PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR, DOÇ. DR. CECILIA GEIJER
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Genetik, Biotechnology, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2026
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Antifungal ilaç dirençliliği, klinikteki rastlanma sıklığının artması nedeniyle küresel boyutta giderek daha önemli bir sorun hâline gelmektedir. Antimisin A gibi doğal antifungal ajanlara karşı gelişen dirençliliğin moleküler mekanizmalarının aydınlatılması, ökaryotik mikroorganizmalarda meydana gelen regülatif ve metabolik yolaklardaki değişimler hakkında önemli bilgiler sağlayabilir ve antifungal ilaç geliştirme çalışmalarına da katkıda bulunabilir. Antimisin A, mitokondriyal kompleks III'ün iyi karakterize edilmiş doğal bir inhibitörüdür. Sitokrom bc1 kompleksinin Qi bölgesine bağlanarak proton taşınımını engellemekte ve mitokondriyal solunumu durdurarak, fermentatif olmayan koşullarda ciddi büyüme inhibisyonuna yol açmaktadır. Ancak mikroorganizmalar, antimisin A'nın inhibitör etkilerini kompleks adaptif yolaklar üzerinden telafi edebilmek için çeşitli mühendislik yaklaşımlarıyla evrimleştirilerek geliştirilebilmektedirler. Bu çalışmada, daha önce elde geliştirilmiş, genetik olarak kararlı ve antimisin A'ya dirençli bir Saccharomyces cerevisiae suşu (ant905-9) kullanılmıştır. Bu suş, herhangi bir mutajenik işlem uygulanmadan, respiratif büyüme koşulları altında, kademeli olarak artan antimisin A konsantrasyonlarına maruz bırakılarak, sistematik kesikli kültür (systematic batch selection) yaklaşımıyla yürütülen evrimsel mühendislik stratejisi ile geliştirilmiştir. Elde edilen ant905-9 suşu, respiratif sıvı besiyerinde (maya azot bazı-etanol) 25 nM'den yüksek antimisin A konsantrasyonlarına tolerans gösterebilirken, referans S. cerevisiae suşu, 1 nM üzerindeki konsantrasyonlarda hayatta kalamamıştır. Dikkat çekici bir şekilde, evrimleşmiş suş hem fermentatif hem de 1 nM antimisin A içeren respiratif koşullar altındaki gelişme analizlerinde lag fazında gecikme göstermeden gelişme hızını korumuştur. Bu durum, kazanılan antimisin A dirençliliğine karşın gelişme özelliklerinde herhangi bir kaybın gerçekleşmediğini göstermektedir. Ayrıca antimisin A'ya dirençli suş, çapraz stres direnci analizlerine göre, antimisin A'ya ek olarak kafein, koniferil aldehit, propolis ve sikloheksimid gibi çeşitli pleiotropik ilaç türevi streslere de direnç kazanmış, öte yandan alüminyum ve kobalt gibi belirli ağır metallere karşı daha hassas hale gelmiştir. Bu durum, kazanılan antimisin A dirençliliğinin karmaşık regülatif yolaklar üzerinden sağlandığını işaret etmektedir. Evrimleşmiş suşun respiratif gelişme koşulları altında yapılan metabolit ve gelişme analizleri, hücre dışı gliserol birikiminde artış ve asetat miktarında azalma olduğunu göstermiştir. Bu durum, mitokondriyal elektron taşınımının bozulduğu koşullarda redoks dengesini korumaya yönelik olası bir metabolik kayma olarak değerlendirilmiştir. Buna ek olarak, evrimleşmiş suşun depo karbonhidrat metabolizmasında da belirgin değişiklikler gözlenmiştir. Maya hücrelerinde çevresel streslere tepki olarak artan ve yedek karbonhidrat depoları olarak görev yapan trehaloz ve glikojen, evrimleşmiş suşta fermentatif koşullarda dahi referans suşa kıyasla daha yüksek düzeylerde üretilmiştir. Antimisin A stresi altındaki respiratif büyüme koşullarında da evrimleşmiş suş, referans suşa kıyasla bu iki depo karbonhidratın daha yüksek seviyelerdeki miktarını korumuştur. Bu gözlemler, evrimleşmiş suşun stres direncini artırmak için karbonhidrat metabolizmasını yeniden programladığını göstermektedir. Mayada stres direncinin bir diğer önemli belirleyicisi olan hücre duvarı bütünlüğü de, referans ve evrimleşmiş suşta karşılaştırmalı olarak incelenmiştir. Litikaz duyarlılık testlerinin sonuçları, evrimleşmiş suşun hem kontrol hem de antimisin A stresi varlığında referans suşa kıyasla daha dayanıklı bir hücre duvarına sahip olduğunu göstermiştir. Antimisin A stres direncinin genetik temellerini aydınlatmak amacıyla, ant905-9 mutant suşu ile referans suş arasında karşılaştırmalı tüm genom yeniden dizileme analizi yapılmış ve amino asit değişikliklerine sebep olan sadece iki adet tek nükleotid varyantı (SNV), PDR1M732R ve PRP8V2218L, tespit edilmiştir. Bu mutasyonların etkilerini analiz etmek amacıyla, her iki mutasyon da CRISPR/Cas9 genom düzenleme tekniğiyle ayrı ayrı ve birlikte olacak şekilde, S. cerevisiae referans suşuna aktarılmış ve elde edilen transformantların farklı streslere direnci çapraz direnç analizleri ile incelenmiştir. Elde edilen sonuçlara göre PDR1M732R mutasyonunun tek başına antimisin A'ya ve diğer pleiotropik etki gösteren ilaçlara karşı yüksek düzeyde direnç kazandırmak için yeterli olduğu görülmüştür. Bu bulgular, Pdr1p transkripsiyon faktörünün geliştirilmiş mutant mayanın direnç mekanizmalarında merkezi bir rol oynadığını ve PDR ağının kompleks regülatif mekanizmalarını işaret etmektedir. PDR1M732R mutasyonunun moleküler sonuçlarını daha ayrıntılı incelemek için, antimisin A stresi yokluğunda, tersine mühendislik ile oluşturulmuş Pdr1p.M732R mutant suşu ile referans suş arasında karşılaştırmalı transkriptom analizi (RNA dizileme) gerçekleştirilmiştir. Transkriptomik sonuçlar, PDR1 genine bağlı ABC taşıyıcı sisteminin genel aktivasyonunu göstermektedir. En yüksek gen ifadesi artışı görülen genler PDR5 (6.31 kat), PDR10 (2.35 kat) ve YOR1 (2.57 kat) genleri olmuştur. Ayrıca, veziküler taşınım (VPS3, TRS33), endoplazmik retikulum organizasyonu (OST2, OST5, PER33) ve oksidatif stres yönetimi (GPX2) ile ilişkili genlerin ifadesinin de anlamlı biçimde artış gösterdiği gözlenmiştir. Bu durum protein katlanma ve membran organizasyonu gereksinimindeki artışa işaret etmektedir. Dikkat çekici bir şekilde, otofaji ile ilişkili bazı genlerin (ATG12, TRS33, VPS3) ifadesi artış gösterirken, otofaji ile ilişkili bir başka gen olan ATG16' nın ifadesinde ise düşüş gözlenmiştir. Benzer şekilde, hücre iskeletiyle ilişkili ARP10 ve SPC110 genleri ve plazma membran proteinlerinin geri dönüşümünde rol oynayan, endozomal protein kodlayan COS8 geninin ifadesi de azalmıştır. Gen Ontolojisi (GO) zenginleştirme ve KEGG yolak analizleri, ifadesi artış göstermiş gen grubunda en anlamlı şekilde zenginleşmiş biyolojik süreçlerin“ABC taşıyıcı aktivitesi”,“membranlar arası taşınım”,“siderofor taşınımı”,“zenobiyotik detoksifikasyonu”ve“otofaji”olduğunu göstermiştir. Bu transkriptomik değişiklikler, çoklu ilaç direncine ait fenotipik gözlemlerle de uyumludur ve PDR yolağının merkezi rolünü desteklemekte ve ayrıca membran dönüşümü ve organel bakımına yönelik seçici otofajik yolların varlığına işaret etmektedir. Tüm bu bulgular, evrimsel mühendisliğin, antifungal ilaç direnci gibi karmaşık özelliklerin geliştirilmesinde etkili bir strateji olduğunu göstermektedir. Evrimsel mühendislikle elde edilmiş, antimisin A stresine dirençli mutant suşun fizyolojik ve genomik analizleri ve ayrıca CRISPR/Cas9 tabanlı tersine mühendisliğinin bir arada kullanılması sayesinde, tanımlanan nokta mutasyonlarının rolleri ve moleküler etkileri doğrulanmış ve ayrıntılı biçimde analiz edilmiştir. Tersine mühendislik ile oluşturulmuş Pdr1p.M732R suşu ve daha önce evrimleşmiş, kafeine (caf905-2), koniferil aldehite (BH13) ve propolise (FD11) dirençli S. cerevisiae suşlarına ait bulgular, PDR1 geninin pleiotropik ilaç direncindeki kilit rolünü vurgulamakta ve PDR1M732R mutasyonundan kaynaklı mekanizmaların, hâlen tam olarak aydınlatılmamış, birbiriyle örtüşen birden fazla yolağı kapsadığını işaret etmektedir. Gelecek çalışmalar kapsamında, PDR1 ile ilişkili genlerin hedefli delesyonları ve bunların fizyolojik, biyoinformatik ve proteomik analizleriyle desteklenmesine odaklanan bütüncül bir yaklaşım, taşıyıcı proteinlerin ve düzenleyici ağların gözlenen dirençli fenotiplere özgül katkılarını ortaya koyabilecektir.
Özet (Çeviri)
Antifungal drug resistance is a growing global concern due to its increasing clinical prevalence. Elucidation of the molecular mechanisms underlying resistance to natural antifungal agents, such as antimycin A, can provide insights into the regulatory and metabolic reprogramming mechanisms that occur in eukaryotic microorganisms and also contribute to antifungal drug development studies. Antimycin A is a well-characterized, natural inhibitor of the mitochondrial complex III, where it binds to the Qi site of the cytochrome bc1 complex and interferes with proton translocation, leading to a collapse in mitochondrial respiration and severe growth inhibition under non-fermentative conditions. However, microorganisms can be engineered and evolved in order to compensate for the inhibitory effects of antimycin A by complex adaptive responses. In this study, a previously developed and genetically stable, antimycin A-resistant Saccharomyces cerevisiae strain (ant905-9) was used. It had been developed by using an evolutionary engineering strategy, without prior mutagenic treatment and by applying a systematic batch selection approach under respirative growth conditions with gradually increasing antimycin A concentrations. The evolved strain, ant905-9, could tolerate antimycin A concentrations higher than 25 nM in liquid respiratory (yeast nitrogen base-ethanol) medium, whereas the reference strain was unable to survive concentrations higher than 1 nM. Remarkably, the evolved strain maintained its growth rate without an extended lag phase under both fermentative and respiratory growth conditions supplemented with 1 nM antimycin A, indicating that antimycin A resistance did not impair the growth of the evolved strain. Additionally, stress cross-resistance analyses showed that ant905-9 strain was resistant to several pleiotropic drug-related stressors including caffeine, coniferyl aldehyde, propolis extract, and cycloheximide, in addition to antimycin A. Nevertheless, it became more susceptible to some heavy metals, such as cobalt and aluminum, indicating the complex regulatory effects of antimycin A-resistance. Growth and metabolite profiling under respiratory growth conditions showed a decrease in acetate accumulation and an increase in glycerol production possibly due to a metabolic shift to preserve redox balance under conditions of impaired mitochondrial electron transport. Additionally, the evolved strain ant905-9 showed significant alterations in storage carbohydrate metabolism. Trehalose and glycogen are the reserve carbohydrates in yeast and are typically upregulated in response to environmental stresses. These carbohydrate levels were found to be elevated in the evolved strain, even under fermentative conditions. In comparison to the reference strain, the evolved strain retained greater amounts of both carbohydrates under respiratory and antimycin A-stress conditions. These findings imply that the evolved strain improved stress tolerance by reprogramming its carbohydrate metabolism. Another critical determinant of yeast stress tolerance, the cell wall integrity, was also examined in the evolved strain. Findings from the lyticase susceptibility experiments suggested that the evolved strain ant905-9 has a stronger cell wall than the reference strain, regardless of antimycin A stress. To elucidate the genomic changes that cause antimycin A-resistance, comparative whole-genome resequencing analysis was conducted between the evolved ant905-9 strain and the reference strain. Interestingly, only two single-nucleotide variants (SNVs), PDR1M732R and PRP8V2218L, were detected, which also resulted in amino acid substitutions. To analyse their individual contributions, both point mutations were introduced separately and together into the prototrophic background reference strain, using CRISPR/Cas9 genome editing strategy. Cross-resistance analysis of the resulting mutants showed that the PDR1M732R mutation alone was sufficient to confer high-level resistance to antimycin A, as well as to the other pleiotropic drugs. These findings confirmed that Pdr1p, a key transcription factor, may contribute significantly to the acquired resistance and indicated the complex regulatory mechanisms of the pleiotropic drug resistance (PDR) network. To determine the molecular consequences specifically caused by the PDR1M732R mutation, comparative transcriptomic analysis was performed between the reverse-engineered Pdr1p.M732R mutant strain and the reference strain, under non-stress conditions using RNA sequencing. The results revealed a global activation of the PDR1-dependent ABC transporter system, with the most strongly upregulated genes PDR5 (6.31-fold), PDR10 (2.35-fold), and YOR1 (2.57-fold). Furthermore, genes involved in vesicular trafficking (VPS3, TRS33), endoplasmic reticulum organization (OST2, OST5, PER33), and oxidative stress management (GPX2) were significantly upregulated, indicating increased intravesicular trafficcing and cellular demand for protein folding, as well as membrane organization. Notably, while some autophagy-related genes (ATG12, TRS33, and VPS3) were upregulated, ATG16, another autophagy-related gene, was downregulated. Similarly, some genes related to structural cytoskeletal components, ARP10 and SPC110, and a gene that encodes an endosomal protein involved in the turnover of plasma membrane proteins COS8, were also downregulated. Gene Ontology (GO) enrichment and KEGG pathway analyses further highlighted that“ABC transporter activity,”“transmembrane transport,”“siderophore transmembrane transport,”“xenobiotic detoxification,”and“autophagy”were the most significantly enriched biological processes in the upregulated gene set. These transcriptomic alterations align with the phenotypic observations of multidrug resistance, support the central role of the PDR pathway in the adaptive mechanism and also suggest a selective autophagic pathway for membrane turnover and organelle maintenance. Taken together, these findings demonstrate that evolutionary engineering serves as an effective strategy to develop complex traits such as antifungal drug resistance. Owing to the combined physiological, genomic and transcriptomic analyses and reverse engineering using CRISPR/Cas9, the roles of the identified point mutations and their molecular effects can be verified and analysed in detail. The reverse-engineered strain Pdr1p.M732R and the previously evolved S. cerevisiae strains resistant to propolis (FD11), coniferyl aldehyde (BH13) and caffeine (caf905-2) stress highlight the key role of the PDR1 gene in pleiotropic drug resistance and suggest that the mechanism underlying the PDR1M732R mutation likely involves multiple, overlapping pathways that remain to be fully elucidated. As a future work, a comprehensive study focusing on targeted deletions of PDR1-related genes and their combined physiological, bioinformatic, and proteomic analyses would shed light on the specific contributions of individual transporters and regulatory networks to the observed resistant phenotypes.
Benzer Tezler
- Evolutionary engineering and physiological analysis of antimycin-a resistant Saccharomyces cerevisiae
Antimisin-a dirençli Saccharomyces cerevisiae'nin evrimsel mühendisliği ve fizyolojik analizi
ALİCAN TOPALOĞLU
Yüksek Lisans
İngilizce
2018
Genetikİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
- Inverse metabolic engineering and molecular characterization of caffeine-resistant saccharomcyes cerevisiae
Kafeine dirençli saccharomcyes cerevisiae'nin tersine metabolik mühendislik ile eldesi ve moleküler karakterizasyonu
YUSUF SÜRMELİ
Doktora
İngilizce
2020
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
- Nükleer rezonasta moleküler yapıların incelenmesi (yapısal faz geçiş kuramları üzerine bir inceleme)
Başlık çevirisi yok
ABDURRAHMAN ANDİÇ
Yüksek Lisans
Türkçe
1986
Fizik ve Fizik MühendisliğiUludağ ÜniversitesiFizik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AYTAÇ YALÇINER
- 1,3-difenil-4,5-bis(hidroksiimino)-imidazolidin ve Ni(II), Cu(II), Pd(II), UO2(VI) komplekslerinin sentezi
Başlık çevirisi yok
VEFA AHSEN
Doktora
Türkçe
1984
Kimya MühendisliğiUludağ ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ÖZER BEKAROĞLU
- NH3 için önerilen yeni bir gerçek gaz hal denklemi ve bu hal denklemi ile bazı moleküler-fiziksel özelliklerin saptanması
Başlık çevirisi yok
MERAL HOŞCAN