Geri Dön

Molecular biology and geneties of dipeptide biosynthesis: The system is an essential component of quaum-sensing colobal regulation

Dipeptid biyosentezinin moleküler biyoloji ve genetiği: Sistem, hücre yoğunluğunun algılandığı global düzenleme zincirinin çok önemli bir halkasıdır

  1. Tez No: 93291
  2. Yazar: AYTEN KARATAŞ (YAZGAN)
  3. Danışmanlar: PROF. DR. GÜLAY ÖZCENGİZ, PROF. DR. MOHAMED A. MARAHİEL
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Bacilysin, bacilysin sentetaz, peptid antibiyotikler, sekonder metabolitler, B. subtilis, sporulasyon, kompetens. vuı, Basilisin, Biyootografi, Biyosentez, Dipeptid, Moleküler biyoloji, İnce tabaka kromatografisi, Bacilysin, bacilysin synthetase, peptide antibiotics, secondary metabolites, B. subtilis, sporulation, competence, Bioautography, Biosynthesis, Dipeptide, Molecular biology, Thin layer chromatography
  7. Yıl: 2000
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

ÖZET DİPEPTİD BİYOSENTEZİNIN MOLEKULER BİYOLOJİ VE GENETİĞİ: SİSTEM, HÜCRE YOĞUNLUĞUNUN ALGILANDIĞI GLOBAL DÜZENLEME ZİNCİRİNİN ÇOK ÖNEMLİ BİR HALKASD3IR Karataş, Ayten Doktora, Biyoteknoloji Bölümü Tez yöneticisi: Prof. Gülay Özcengiz Ortak tez yöneticisi: Prof. Mohamed A. Marahiel Eylül 2000, 141 pages B. subtilis PY79'da (standard 168 susunun prototrofik türevi) dipeptid antibiyotik bacilysin biyosentezinden sorumlu genlerin izolasyonu için transpozon mutaj enezi yaklaşımı kullanılmıştır. Bloke olmuş mutantlar transpozon kütüphanesinden biyoassay yoluyla fenotipik olarak seçilmiş, daha sonra ESI-kütle spektrometri analizleri ile biyosentetik kapasiteyi tamamen kaybeden mutantlar belirlenmiştir. Transpozon kütüphanesinden 4 farklı bacilysin üretemeyen mutant [AKİ, AK2, AK3, and AK4] izole edilmiş, bu mutantlarda bloke olan genler klonlanmış, nükleotid dizileri analiz edilerek ilgili genler karakterize edilmiştir. Bu genler, sırasıyla, ihyA (timidilat sentetaz), ybgG (bilinmeyen protein, homoserin methyl VItransferazlara benzemektedir) ve oppA (oligopeptid permeaz) olarak belirlenmiştir. Opp proteinin bacilysin biyosentezi ile ilgisinin kanıtlanması, biyosentezin“hücre yoğunluğunun algılandığı”ve sporlanmamn (farklılaşmamn) başlamasından, kompetans oluşmasmdan ve bazı B. subtilis suşlannda surfaktin biyosentezinin gerçekleşmesinden sorumlu global kontrol (fosforelay sistemi) zincirinde esasiyel bir yer oluşturduğunu açığa çıkarması bakımından çok önemli bir bulgudur. İlgili fizyolojik çalışmalar, bu bulguyu daha da güçlendirmiştir. Yine bu çalışma kapsamında kısmen saflaştırılmış bir enzim fraksiyonu kullanılarak biyosentetik mekanizmaya ilişkin araştırmalar da yapılmıştır. In vitro bacilysin biyosentezi, sentezlenen antibiyotiğin saf bacilysin ile ince tabaka kromatografi ve biyootografi yöntemleri kullanılarak karşılaştırılması ile doğrulanmıştır. Yüksek basmçlı jel filtrasyon kromatografisi (Superdex 200 kolonu) ile büyüklüğü yaklaşık 125 kDA olarak belirlenen enzim, DEAE- Sepharose kolonu kullanılarak gerçekleştirilen yüksek basmçlı anyon kromatografisi ile daha ileri saflaştırılmıştır. Enzimatik bacilysin biyosentezinin ATP yada 2'-deoxy ATP'ye ve yapışım oluşturan amino asitlerin varlığına gereksinim gösterdiği gösterilmiştir. Amino asit aktivasyonu mekanizmasının belirlenmesi için, yapısındaki amino asitlerle, L- alanin ve L-anticapsin ile ATP- PPi ve ATP-Pi değişim reaksiyonları yapılmıştır. Enzim, L-alanin'e bağlı ATP- PPi değişim reaksiyonunu katalizlemiş, ancak diğer sübstratı L-anticapsin' i aym yolla aktive etmemiştir. Bir modifiye amino asit olan anticapsin'in“amino asit fosfat”formunda aktive edildiğine dair de herhangi bir ipucuna rastlanmamıştır. Pantotenik asitin biyosentetik enzimde yer aldığı gösterilmiş, L-alanin'in tiyoester Vllformunda enzime bağlandığının kamtianmsı pantotenik asit varlığına ilişkin sonucu desteklemiştir. Tüm bu bulgular, bacilysin biyosentezi mekanizmasının peptid sentetazlar için önerilen“çoklutaşıyıcı tiyokalıp modeli”ile tüm olarak örtüşmediğini göstermiş olup peptid biyosentezinde alternatif model(ler)in varlığma işaret etmiştir. Bu çalışmada, bacilysinin hızlı ve hassas tayini için HPLC-ESI kütle analizi yöntemi geliştirilmiş ve ilgili moleküler çalışmalarda etkin bir biçimde kullanılmıştır.

Özet (Çeviri)

ABSTRACT MOLECULAR BIOLOGY AND GENETICS OF DIPEPTIDE BIOSYNTHESIS: THE SYSTEM IS AN ESSENTIAL COMPONENT OF QUORUM-SENSING GLOBAL REGULATION Karataş, Ayten Ph.D., Department of Biotechnology Supervisor: Prof. Gülay Özcengiz Co-supervisor: Prof. Mohamed A. Marahiel September, 2000, 141 pages Transposon mutagenesis was employed to isolate the gene(s) related with the biosynthesis of dipeptide antibiotic bacilysin in Bacillus subtilis PY79 (a prototrophic derivative of the standard 168 strain). The blocked mutants were phenotypically selected from the transposon library by bioassay and the complete loss of biosynthetic ability was verified through ESI-mass spectrometry analyses. Four different bacilysin nonproducer mutants [Bac"::TnlO (pri-spc)] were isolated from the transposon library. The disrupted genes from these mutants were cloned, sequenced and characterized. The genes involved in bacilysin biosynthesis were identified as thyA (thymidilate synthetase), ybgG (unknown; similar to 111homoserine methyl transferase) and oppA (oligopeptide permease), respectively. Opp involvement was significant as it suggested that bacilysin biosynthesis is an essential component of the quorum-sensing global regulation. phrC and comA deleted mutants of PY79 were next constructed and the latter two genes were shown to be essential for bacilysin biosynthesis. Mechanism of biosynthesis of dipeptide antibiotic bacilysin by a partially purified enzyme fraction prepared from Bacillus subtilis PY79 was also studied. In vitro enzymatical synthesis of bacilysin was confirmed by performing thin layer chromatography. An enzyme fraction (ca. 125 kDa) was prepared by fast flow gel permeation chromatography (Superdex 200 column), which was further purified by anion exchange FPLC (DEAE-Sephadex column). The enzymatic synthesis of bacilysin required either ATP or 2'-deoxyATP and was entirely dependent on the presence of constituting amino acids. To determine the mechanism of amino acid activation, ATP-PPj and ATP-Pi exchange reactions were performed with component amino acids L-alanine and L-anticapsin. The enzyme catalyzed ATP- PPi exchange reaction dependent on L-alanine, but did not activate L-anticapsin in this way. There was also no evidence for activation of this modified amino acid as an amino acid phosphate. Pantothenic acid was liberated from the enzyme fraction as determined microbiologically. Consistently, covalent binding as thioester was shown for L-alanine. IVAn HPLC-ESI mass analysis technique was developed as a fast and sensitive method for bacilysin detection and used effectively in the relevant molecular work.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    83737

    Molecular cloning and characterization of the common 1b subtype of HCV from Turkey

    Türkiye'de baskın olarak görünen hepatit C virüsü 1b alt tipinin moleküler klonlanması ve karakterizasyonu

    ASLI ÖZTAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    1999

    Biyolojiİhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MEHMET ÖZTÜRK

  2. Tez No

    58584

    Bacterial cloning and expression of BRCAZ encoded proteins

    BRCAZ geninin bakteriye klonlanıp ekspresyonu

    A.EMRE SAYAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    1997

    Biyolojiİhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MEHMET ÖZTÜRK

  3. Tez No

    79310

    Expression and purification of the hepatitis c virus core protein in e.coli and testing of human sera with this core antigen

    Hepatit C virüsü core proteininin e.colide expresyonu ve saflaştırması ve insan serumunun bu antigan ile test edilmesi

    ÇAĞLA EROĞLU

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    1998

    Biyolojiİhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DR. ERGÜN PINARBAŞI

  4. Tez No

    47443

    Clonind and purification of a thermostable DNA polymerase

    Isılkararlı bir DNA polimeraz enziminin klonlanması ve saflaştırılması

    EBRU TOKSOY

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    1995

    Kimya MühendisliğiBoğaziçi Üniversitesi

    PROF.DR. BETÜL KIRDAR

    PROF.DR. ZEYNEP İLSEN ÖNSAN

  5. Tez No

    79353

    Molecular analysis of hematological malignancies

    Hematolojik kanserlerde moleküler analiz

    Z.BUKET YILMAZ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    1998

    Biyolojiİhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. TAYFUN ÖZÇELİK

Geri Dön