Cilt bakım ürünlerinin formülasyonunda potansiyel bir bileşen olarak doğal antimikrobiyal peptit üretimi
Production of natural antimicrobial peptide as a potential ingredient in the formulation of skin care products
- Tez No: 842612
- Danışmanlar: PROF. DR. GÜLRUH ALBAYRAK, PROF. DR. KADİR TURAN
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2023
- Dil: Türkçe
- Üniversite: İstanbul Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Doktora tez çalışmasında Zizyphus jujube'nin (hünnap) Snakin-Z antimikrobiyal peptidinin heterolog üretimi ilk kez Escherichia coli'de gerçekleştirildi. Snakin-Z kodlayan AMP'nin nukleotit dizilimi konağın kodon kullanımına göre düzenlendi. Rekombinant pET-14b-SNK vektörü (4771 bç), kalıp ve tamamlayıcı oligonukleotit sentezinden sonra oluşturulan çift iplikli kodlama dizisinin NdeI ile kesilen histidin (His) etiketi içeren pET-14b vektörüne eklenmesiyle oluşturuldu. Snakin-Z kodlayan dizilim pET-14b-SNK'den PZR ile çoğaltıldı ve gulutatyon S-transferaz (GST) etiketi içeren BamHI ile kesilen pGEX-6P-1'e aktarılarak 5085 bç'lik rekombinant pGEX-6P-1-SNK elde edildi. 5464 bç'lik rekombinant pET-14b-GST-SNK, GST/Snakin-Z kodlayan dizilimin pGEX-6P-1-SNK vektöründen PZR ile çoğaltıldıktan sonra NcoI ile kesilen pET-14b plazmitine ligasyonu ile oluşturuldu. Üç vektör sisteminde de klonlanan genleri doğru oryantasyonda ve tek kopyalı taşıyan rekombinantlar seçildi ve Sanger dizi analizi ile doğrulandı. pET-14b-SNK ve pET-14b-GST-SNK rekombinant vektörleri E. coli BL21 (DE3); pGEX-6P-1-SNK ise hem BL21 (DE3) hem Mach1 suşlarına transformasyon ile aktarıldı. Füzyon peptit sentezi için optimal koşulların, her iki suşun transformantlarında, 32 °C sıcaklık ve 100 µM IPTG uygulaması olduğu belirlendi. Üretilen GST/Snakin-Z'ye ait yaklaşık 30 kDa'luk protein bandı hem pGEX-6P-1-SNK hem de pET-14b-GST-SNK vektörlerini taşıyan transformantlarda SDS-PAGE ile görüntülendi ve anti-GST antikoru kullanılarak Western melezleme ile doğrulandı. Kararlı peptit üretimi yüksek hacimde kurulan pET-14b-GST-SNK transformantlarına ait BL21 kültürlerinden sağlandı. GST/Snakin-Z, protein ekstraksiyonundan elde edilen süpernatantlardan glutatyon-agaroz afinite kromatografisi ile yüksek saflıkta ve 10-20 μg/μl miktarda elde edildi. GST/Snakin-Z'nin PreScission Proteazı ile kesimi sonrası PAGE'de gözlenen 26 kDa'lık GST bandı AMP'nin füzyon molekülü olarak üretildiğini doğruladı. Diyaliz ve liyofilizasyon işlemleri sonrası elde edilen ve PBS içerisinde çözülen GST/Snakin-Z'nin antibakteriyal etkisi mikrodilüsyon yöntemiyle araştırıldı. GST/Snakin-Z'nin artan konsantrasyonları (12.5, 25, 50, 100, 150 μM) Gram-pozitif Staphylococcus aureus (ATCC 25923) üremesini %32.17-61.33 azalttı; tüm dozlar kontrole göre istatistiksel olarak anlamlı (p<0.0001) değişime yol açtı. S. aureus üremesini yaklaşık %50 azaltan (IC50) 50 μM GST/Snakin-Z dozu Gram-pozitif Streptococcus agalactiae (DM20) suşunun canlılığını %37.03, S. saprophyticus (DM17)'unkini %9.63 inhibe ederken; Gram-negatif bakterilerin (E. coli ATCC 25922 ve Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853) üremesini etkilemedi. Füzyon peptidinin IC50 değeri verilerin doğrusal olmayan regresyon analizi ile 12.07 μM olarak hesaplandı. 50 μM GST/Snakin-Z'nin sitotoksik etkisi diş pulpası kök hücre (DPKH) kültürlerinde ve L929 hücre hattında uygulama sonrası 48. saatte MTT analizi ile incelendi. Elüsyon tamponu içerisindeki GST/Snakin-Z DPKH ve L929'ların canlılığını sırasıyla %21.53 (p>0.05), %14.40 (p>0.05) azalttı. Diyaliz ile yoğunlaştırılıp ardından liyofilize edilen füzyon peptidi ise DPKH kültürlerinin hücre canlılığını %20.38 (p<0.05) azaltırken L929'unkini %14.51 (p>0.05) arttırdı. In silico yapı analizleri heterolog Snakin-Z'nin ve füzyon peptidinin ikincil yapılarının sarım ve sarmal motiflerinden oluştuğunu; füzyon peptidinin kıvrım yapılarını da taşıdığını gösterdi. İkincil yapılara ait güvenilirlik skorları öngörülen her iki modelin de güvenilir olduğunu gösterdi. Snakin-Z ve GST/Snakin-Z modellerinde çözücü erişilebilirlik değer aralığı 0-8 arasında idi. Modellerinin her ikisinde de negatif B faktörüne sahip bakiye sayısı pozitif olanlardan fazlaydı. Optimum güven skorlu (C-skor) Snakin-Z ve GST/Snakin-Z 3D modelleri Protein Veri Bankasında (PDB) kayıtlı olan proteinlere benzer topolojilere sahipti. Bu iki 3D modelin PDB'de kayıtlı analogları, benzer protein-ligand bağlanma bölgeleri ve enzim homologları ile ilgili bilgilere ulaşıldı. Gen ontolojisi tahminleri ile moleküler fonksiyonları, metabolik süreçlerdeki yeri ve hücresel bileşen olarak rolleri öngörüldü. Snakin-Z modelinin iki, GST/Snakin-Z'nin ise dört olası disülfit bağına sahip olduğu tahmin edildi. Antibakteriyal etkili olup, doğrudan sitotoksik etki göstermeyen 50 μM GST/Snakin-Z AMP'si; %20 (w/v) SLS, %2 (w/v) NaCl, %0.5 (v/v) Triton X-100, %0.2 (w/v) sitrik asit ve %0.1 (v/v) linalool ile bir araya getirilerek saç ve saç derisi bakımına yönelik kozmetik bir ürün olan şampuan formülasyonu oluşturuldu. Moleküler etkileşimlerinin aydınlatılması ile birlikte yüksek ölçekte üretiminin sağlanması durumunda GST/Snakin-Z'nin çeşitli endüstri alanlarında ve farmasötik üretiminde kullanım potansiyeli bulunmaktadır.
Özet (Çeviri)
In the doctoral thesis study, heterelogous production of Snakin-Z antimicrobial peptide of Zizyphus jujube (jujube) was carried out in Escherichia coli for the first time. The nucleotide sequence of the AMP encoding Snakin-Z was adjusted according to the codon usage of the host. The recombinant pET-14b-SNK vector (4771 bp) was constructed by inserting the double-stranded coding sequence generated after template and complementary oligonucleotide synthesis into the pET-14b vector containing a histidine (His) tag digested with NdeI. The Snakin-Z encoding sequence was amplified from pET-14b-SNK by PCR and transferred to BamHI-cleaved pGEX-6P-1 containing a gulutathione S-transferase (GST) tag, resulting in a 5085 bp recombinant pGEX-6P-1-SNK. The 5464 bp recombinant pET-14b-GST-SNK was generated by PCR amplification of the GST/Snakin-Z encoding sequence from the pGEX-6P-1-SNK vector followed by ligation to the pET-14b plasmid digested with NcoI. Recombinants carrying the cloned genes in the correct orientation and single copy in all three vector systems were selected and verified by Sanger sequence analysis. pET-14b-SNK and pET-14b-GST-SNK recombinant vectors were transformed into E. coli BL21 (DE3) and pGEX-6P-1-SNK was transformed into both BL21 (DE3) and Mach1 strains. The optimal conditions for fusion peptide synthesis were determined to be 32 °C temperature and 100 µM IPTG treatment in transformants of both strains. The protein band of approximately 30 kDa of the produced GST/Snakin-Z was visualised by SDS-PAGE in transformants carrying both pGEX-6P-1-SNK and pET-14b-GST-SNK vectors and confirmed by Western hybridisation using anti-GST antibody. Stable peptide production was achieved from BL21 cultures of pET-14b-GST-SNK transformants established in high volume. GST/Snakin-Z was obtained from the supernatants of protein extraction by glutathione-agarose affinity chromatography with high purity and in an amount of 10-20 μg/μl. The 26 kDa GST band observed on PAGE after digestion of GST/Snakin-Z with PreScission Protease confirmed that AMP was produced as a fusion molecule. The antibacterial effect of GST/Snakin-Z, dissolved in PBS after dialysis and lyophilization, was investigated by microdilution method. Increasing concentrations of GST/Snakin-Z (12.5, 25, 50, 100, 150 μM) reduced the growth of Gram-positive Staphylococcus aureus (ATCC 25923) by 32.17-61.33%; all doses lead to a statistically significant (p<0.0001) change compared to control. A dose of 50 μM GST/Snakin-Z, which reduced S. aureus growth by approximately 50% (IC50), inhibited the viability of Gram-positive Streptococcus agalactiae (DM20) by 37.03% and S. saprophyticus (DM17) by 9.63%, while it did not affect the growth of Gram-negative bacteria (E. coli ATCC 25922 and Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853). The IC50 value of the fusion peptide was calculated as 12.07 μM by non-linear regression analysis of the data. The cytotoxic effect of 50 μM GST/Snakin-Z was examined in dental pulp stem cell (DPKH) cultures and L929 cell line by MTT assay at 48 h after treatment. GST/Snakin-Z in elution buffer decreased DPKH and L929 viabilities by 21.53% (p>0.05) and 14.40% (p>0.05), respectively. The fusion peptide concentrated by dialysis and then lyophilised decreased cell viability of DPKH cultures by 20.38% (p<0.05) while increased that of L929 by 14.51% (p>0.05). In silico structure analyses showed that the secondary structures of the heterologous Snakin-Z and the fusion peptide consisted of coiling and helical motifs; the fusion peptide also carried the strand structures. The confidence scores of the secondary structures showed that both predicted models were reliable. The range of solvent accessibility values in the Snakin-Z and GST/Snakin-Z models ranged from 0 to 8. The number of residues with negative B-factor was higher than the number of positive residues in both models. The Snakin-Z and GST/Snakin-Z 3D models with optimum confidence scores (C-score) had similar topologies to the proteins in the Protein Data Bank (PDB). Information on their PDB analogues, similar protein-ligand binding sites and enzyme homologues of these two 3D models were obtained. Their molecular functions, roles in metabolic processes and cellular components were predicted with gene ontology predictions. The Snakin-Z and GST/Snakin-Z models were predicted to have two and four possible disulphide bonds, respectively. A shampoo formulation, a cosmetic product for hair and scalp care, was created by combining 50 μM GST/Snakin-Z AMP, which has antibacterial effect and does not show direct cytotoxic effect, with 20% (w/v) SLS, 2% (w/v) NaCl, 0.5% (v/v) Triton X-100, 0.2% (w/v) citric acid and 0.1% (v/v) linalool. GST/Snakin-Z has the potential to be used in various industrial fields and pharmaceutical production if its molecular interactions are elucidated and its high scale production is ensured.
Benzer Tezler
- Çanakkale ve çevresi artiodactyla fosilleri (paleontoloji, biyostratigrafi, paleoekoloji ve paleobiyocoğrafya) (2 cilt)
Başlık çevirisi yok
VAHDET TUNA
- Anadolu Türkçesi ile yapılan en eski Tezkiretü'l-Evliya tercümesi ve dil özellikleri (2 cilt)
Başlık çevirisi yok
ORHAN YAVUZ
Doktora
Türkçe
1986
Türk Dili ve EdebiyatıAtatürk ÜniversitesiTürk Dili ve Edebiyatı Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. A. MERTOL TULUM