Geri Dön

Investigating the role of pericytes in multiple sclerosis by inducing experimental autoimmune encephalomyelitis in genetically modified mouse models

Transgenik farelerde deneysel alerjik ensefalomiyelitis modeli kullanılarak multipl skleroz hastalığında perisitlerin rolünün incelenmesi

PDF İndir

  1. Tez No: 704012
  2. Yazar: DİLA ATAK
  3. Danışmanlar: PROF. DR. YASEMİN ÖZDEMİR, DOÇ. DR. ATAY VURAL
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Nöroloji, Tıbbi Biyoloji, Moleküler Tıp, Neurology, Medical Biology, Molecular Medicine
  6. Anahtar Kelimeler: KBan-Beyin Bariyeri, Perisit, Perisit Ablasyonu, Pdgfrβ, Multiple Sclerosis, Deneysel Allergic Ensefalomiyelit, Transjenik Fare Modelleri, Ablasyon, Alerjenler, Ensefalomiyelit, Fareler, Hayvan deneyleri, Kan beyin bariyeri, Multipl skleroz, Perisitler, Blood-Brain Barrier, Pericytes, Pericyte Ablation, Pdgfrβ, Multiple Sclerosis, Experimental Allergic Encephalomyelitis, Transgenic Mouse Models, Ablation, Allergens, Encephalomyelitis, Mice, Animal experimentation, Blood brain barrier
  7. Yıl: 2021
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Koç Üniversitesi
  10. Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Nöroloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Sinirbilim Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

Giriş: Perisitler, endotel hücrelerinin abluminal tarafında yer alan mural hücrelerdir. Bu hücreler kan-beyin bariyeri (KBB) oluşumunda ve santral sinir sistemi (SSS) bağışıklık homeostazını sağlamada önemli rollere sahiptirler. Son yıllarda, perisit hücre kültürleriyle ve iyi karakterize edilmiş perisit ablete fare modelleyle yapılan çalışmalar, perisitlerin ayrıca immünomodülatör fonksiyonlara sahip olduğunu göstermektedir. Fakat, bu çalışmalarda kullanılan hayvanlar doğuştan perisit eksikliği olan fare modelleridir ve zaten yetersiz bir BBB oluşumuna ve bozulmuş bir mikrovaskülatür morfolojiye sahiptirler. Ayrıca, gelişmekte olan farelerde perisitlerin kısmi ablasyonu, hem normal fizyolojik durumda hem de patolojik koşullarda lökositlerin SSS'e infiltrasyonunun artmasına neden olduğu bilinmektedir. Bu anormallikler, nöroinflamatuar hastalıklarda perisit fonksiyonuyla ilgili gerçek bulguları gölgeyleyebilir. Bu nedenle, mevcut perisit eksikliği modellerini kullanarak perisitlerin nöroinflamatuar rollerini incelemek, bulgular hakkında güvenli sonuçlar çıkarma konusunda yetersiz kalmaktadır. En yaygın nöroinflamatuar CNS hastalığı Multipl Skleroz'dur (MS). MS hastalığı periferik inflamatuar hücrelerin KBB'nin açılmasından sonra beyne sızdığı ve miyelin kılıflarının, oligodendrositlerin ve altta yatan sinir liflerinin dejenerasyonuna neden olduğu bir otoimmünite hastalığıdır. Başlangıçta bu bağışıklık hücrelerinin CNS parankimine olağandışı geçişine neden olan hücreler henüz net olarak tanımlanmamıştır. Bunun yanı sıra, hastalığın patogenezi sırasında meydana gelen olaylar dizisi de bilinmemektedir. Amaç: Bu çalışmada, ilk olarak, normal gelişmiş vasküler yapıya ve sağlıklı KBB'ye sahip yetişkin farelerde tamoksifen ile indüklenebilir bir perisit ablasyon modeli oluşturmayı ve karakterize etmeyi amaçladık. İkinci olarak, en sık kullanılan MS benzeri nöroinflamasyon modeli olan deneysel alerjik ensefalomiyelit (DAE) modeli aracılığıyla perisit yokluğunun MS patogenezine etkilerini araştırdık. Yöntem: Indüklenebilir perisit ablasyon modelimizi oluşturmak için PDGFRβ-PA2-CreER+/- fareler (JAX Laboratories, 030201) ile Rosa26-DTA176+/+ fareler (JAX Laboratories, 010527) çaprazlandı. Bu çiftleşme sonucu elde edilen 9-10 haftalık yavrular genotiplendikten sonra, Pdgfrβ-positive perisitlerinde difteri toksin ifadesini indüklemek için iki (2X), üç (3X) veya beş (5X) ardışık gün boyunca intraperitonel yolla 100 mg/kg tamoksifen enjeksiyonları yapıldı. PDGFRβ-Cre+/DTA176+ (Cre-pozitif) fareler perisit ablasyon grubu olarak ve PDGFRβ-Cre-/DTA176+ (Cre-negatif) fareler kontrol olarak karakterize edildi. Modelimizi karakterize etmek için, her iki grubun beyin ve omurilik dokularında endotel üzerindeki perisit kaplama alanı, PDGFRβ gen ifade seviyesi ve damar ilişkili değişiklikler incelendi. İncelemeler için sırasıyla immünohistokimya, kantitatif PCR ve AngioTool 1 yazılımı kullanıldı. Analizler kısa dönem (15 gün) ve uzun dönem (60 gün) için ayrı ayrı yapıldı. Ek olarak, uzamsal tanıma belleği (Y-labirent performansı) ve lokomotor aktivite (Kavrama Kuvveti Testi) davranış testleri yapıldı. Karakterizasyon deneylerinin sonuçlarına göre, sonraki DAE deneyleri için iki ardışık gün TAM enjeksiyonu (2X TAM) ile indüklenen perisit ablasyon grubu seçildi. DAE modeli, TAM enjeksiyonlarından 15 gün sonra MOG35-55 DAE kiti (Hooke Labs, EK2110) ile başlatıldı. DAE deneylerinde perisit ablasyonu kontrolü olarak kontrolleri olarak Cre-negatif ve yabanıl tip C57BL/6 fareleri kullanıldı ve sonuçlar tartışılırken iki grup birlikte“yabanıl tip fareler”olarak değerlendirildi. DAE deneyleri başlatıldıktan sonra, ağırlık ve klinik semptom varyasyonları 28 gün boyunca izlendi. İstatistiksel analiz, 2-yönlü ANOVA tekrarlanan ölçümler çoklu karşılaştırma testi ile yapıldı. Bulgular: Perisit endotel kaplama alanında cortekste %75 (+-SEM=0.9192) (p<0.01) ve omurilikte %40 (+-SEM=2.385) azalma (p<0.01) gözlemlendi. 2X TAM perisit ablasyon grubu fareler (n=8), Cre-negatif kontroller (n=7) ile karşılaştırıldığında, perisit kaplama alanı sonuçlarına benzer şekilde, Pdgfrβ gen ekspresyonu kortekste %55'e (+-SEM=2.230) (p=0.036) ve omurilikte %60'a (+-SEM=4.511) düştü (p=0.036). Damar analizleri ve davranış analizleri ise, 2X TAM perisit ablasyonlu grup ile Cre-negatif kontroller arasında önemli bir fark olmadığını ortaya koydu. Bu sonuçlardan yola çıkarak DAE deneylerinde 2X TAM ile oluşturulan perisit ablete farelerin kullanılması kararlaştırıldı. DAE sırasında, perisit ablasyonlu fareler (n=7) ve yabanıl tip fareler (n=23), DAE modelinin 15. gününe kadar skor 1.5 seviyesine benzer klinik gelişime sahipti. Fakat, deneyin bu noktasından sonra, perisit ablasyonu yapılmış farelerin semptomlarının daha yüksek bir alevlenme oranı ile kötüleştiği izlendi. Bu fark 20. günden sonra istatistiksel olarak anlamlılık kazandı ve bu anlamlılık deneyin sonuna kadar devam etti (20-28. günlerde p= 0.0141, 0.0056, 0.008, 0.0276 ve 0.0188). Eşzamanlı olarak, DAE'nin ilk semptomlarından başlayarak, perisit ablasyonu yapılmış fareler yabanıl tip farelerden daha fazla kilo kaybettiler (p= 0.0411, 0.0067, 0.0236, 0.0093, 0.01, 0.0194 ve 0.0081, 8. gün ve 16-28. günlerde). Öte yandan omurilik dokularının immünohistokimyasal analizi, yabanıl tip farelerin lezyonlarına kıyasla perisit ablasyonlu farelerde enflamatuar lezyonların sayısının ve boyutunun daha fazla ve daha büyük olduğunu ortaya koydu. Ek olarak, beynin periventriküler bölgesi, perisit ablasyonlu farelerde benzeri görülmemiş enflamatuar odaklar sunarken, yabanıl tip DAE'li fare beyinlerinde herhangi bir hücre birikimi gözlenmedi. Sonuç ve Yorum: Bu projede, yetişkin farelerde TAM ile indüklenebilir bir perisit ablasyon modeli oluşturuldu ve karakterize edildi. Bu yeni nesil perisit ablasyon modelinin diğer modellere kıyasla avantajı, bu modelde perisit ablasyonunun hem de ablasyon miktarının hem de ablasyonun başlangıç zamanının kontrol edilebilmesi ve bu kontrol süreçlerinde modelin herhangi bir toksin enjeksiyonu gerektirmemesidir. Bu proje kapsamında, perisit ablasyon modelimizin DAE modelinde kullanılmasıyla, perisitlerin nöroinflamasyonun çözülmesi sırasında koruyucu bir rol oynadığı gösterilmiştir.

Özet (Çeviri)

Background: Pericytes are mural cells positioned on the abluminal side of endothelial cells. They have crucial roles in blood-brain-barrier (BBB) maturation and maintaining immune homeostasis in the central nervous system (CNS). Recent studies of pericyte cell cultures and well-characterized pericyte deficiency mouse models suggest that pericytes also have immunomodulatory functions. However, the animals used in these studies are inborn pericyte-deficient mouse models that already have a deficient BBB formation and a disrupted microvasculature morphology. Furthermore, partial ablation of pericytes in developing mice leads to increased infiltration of leukocytes to the CNS in later life, both in steady-state and pathological conditions. These abnormalities might confound the actual findings related to the pericyte function in neuroinflammatory diseases. Therefore, studying the neuroinflammatory roles of pericytes by using the existing pericyte deficiency models is incompetent in making confident conclusions about the findings. The most ubiquitous neuroinflammatory CNS disease is Multiple Sclerosis (MS). It is a disease of autoimmunity in which the peripheral inflammatory cells infiltrate the brain after the opening of BBB, resulting in the degeneration of myelin sheaths, oligodendrocytes, and underlying nerve fibers. The players initially causing the preternatural passage of these immune cells to the CNS parenchyma are not clearly defined yet. Besides, the line of events happening during the pathogenesis of the disease is also not well-known. Aim: In this study, we first aimed to generate and characterize a tamoxifen-inducible pericyte ablation model in adult mice that have a properly developed vasculature and mature BBB. Secondly, we sought to investigate the effect of pericyte loss in MS pathogenesis through the most frequently used model of MS-like neuroinflammation, the experimental allergic encephalomyelitis (EAE) model. Methods: To create our inducible pericyte ablation model, PDGFRβ-PA2-CreER+/- mice (JAX Mice, 030201) were crossed with Rosa26-DTA176+/+ mice (JAX Mice, 010527). After genotyping, 9-10 weeks old progeny was intraperitoneally injected with 100 mg/kg tamoxifen for two (2X), three (3X), or five (5X) consecutive days to induce the expression of diphtheria toxin in Pdgfrβ-positive pericytes. PDGFRβ-Cre+/DTA176+ (Cre-positive) mice were characterized as pericyte ablation group, and PDGFRβ-Cre-/DTA176+ (Cre-negative) mice were used as controls. To characterize our model, the level of pericyte coverage, Pdgfrβ gene expression, and vasculature changes were examined in the brain and spinal cord tissues of both groups. To do so, immunohistochemistry, quantitative PCR, and AngioTool software were used, respectively. The analyses were separately done for the short-term (15 days) and long-term (60 days). Additionally, behavioral tests of spatial recognition memory (Y-maze performance) and locomotor activity (Grip Strength Test) were run. According to the results of the characterization experiments, the pericyte ablation group that was administered with two consecutive days of TAM injections (2X TAM) was selected for further EAE experiments. EAE was induced by MOG35-55 EAE kit (Hooke Labs, EK2110) 15 days after TAM injections. Cre-negative and wild-type C57BL/6 mice were used as pericyte ablation controls for EAE experiments, and they together were considered as“wild-type mice”when discussing the results. After EAE induction, weight and clinical symptom variations were monitored and scored for 28 days. Statistical analysis was done by repeated-measures 2-way ANOVA multiple comparison test. Results: There was a 75% (+-SEM=0.9192) decrease in pericyte coverage of the cortex (p<0.01) and a 40% (+-SEM=2.385) decrease in the pericyte coverage of the spinal cord (p<0.01) in the 2X TAM pericyte ablation group mice (n=8) compared to the Cre-negative controls (n=7). Similarly, Pdgfrβ gene expression was decreased to 10 % (+-SEM=2.230) in the cortex (p=0.036) and 60% (+-SEM=4.511) in the spinal cord (p=0.036). The vessel analysis and the behavioral analysis revealed no significant differences between the 2X TAM pericyte ablated group and Cre-negative controls. Based on these results, pericyte ablated mice created with 2X TAM were chosen to be used in EAE experiments. During EAE, the pericyte ablated mice (n=7) and the wild-type mice (n=23) had similar clinical progression up to score 1.5 until the 15th day of the EAE induction. However, after that time point, the symptoms of the pericyte ablated mice started to worsen with a higher exacerbation rate. This difference got statistically significant after Day 20 and continued till the end of the experiment (p= 0.0141, 0.0056, 0.008, 0.0276, and 0.0188 at Day20-28). Concurrently, starting with the first symptoms of EAE, pericyte ablated mice also lost more weight than the wild-type mice (p= 0.0411, 0.0067, 0.0236, 0.0093, 0.01, 0.0194, and 0.0081 at Day8 and Day16-28). On the other hand, the immunohistochemical analysis of the spinal cord tissues revealed that the number and the size of inflammatory lesions were more and larger in the pericyte ablated mice compared to the lesions of the wild-type mice. Additionally, the periventricular region of the brain presented unprecedented inflammatory foci in pericyte ablated mice, while the wild-type EAE mice did not show any cell accumulations in the brain. Conclusion and Comment: This project has generated and characterized a TAM inducible pericyte ablation model in adult mice. The advantages of this new generation pericyte ablation model over the other pericyte deficiency models are that pericyte ablation amount and ablation induction time could be controlled, and while so, the model does not require the injection of any toxin. In this project, by using our pericyte ablation model in combination with the EAE model, pericytes were shown to play a protective role during the resolution of neuroinflammation.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    474649

    Multipl skleroz hastalarında klinik seyir ile perisit fonksiyonlarının ilişkisinin araştırılması

    The investigation of the relationship between clinical pattern and peristic functions in multiple sklerosis patients

    TUBA TANYEL KİREMİTÇİ

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2017

    NörolojiSağlık Bilimleri Üniversitesi

    Nöroloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. RECAİ TÜRKOĞLU

  2. Tez No

    248255

    İskemi ve reperfüzyon sonrasi erken dönemde kan beyin bariyerinin zedelenmesinde nitratif ve oksidatif mekanizmalarin farede kranial pencere ve izole retina modellerinde incelenmesi

    Effects of nitrative/oxidative stress mechanisms on early blood brain barrier injury after ischemia/ reperfusion studied by cranial window and isolated retina models

    ATAY VURAL

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2010

    NörolojiHacettepe Üniversitesi

    Temel Nörolojik Bilimler Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. YASEMİN GÜRSOY ÖZDEMİR

  3. Tez No

    602381

    Kolonik subepitelyal ve perikriptal myofibroblastlar için immunohistokimyasal belirteçlerin tanımlanması ve neoplastik süreçteki ifadelerinin araştırılması

    Identification of immunohistochemical markers for colonic subepithelial and pericryptal myofibroblasts and investigation of their expressions in the neoplastic process

    KÜBRA KATİPOĞLU

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2019

    PatolojiHacettepe Üniversitesi

    Tıbbi Patoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AYTEKİN AKYOL

  4. Tez No

    183494

    Investigating the role of zoledronic acid on interleukin-6 cytokine expression in prostate cancer cell lines

    Prostat kanseri hücre hatlarında zoledronik asidin interlökin-6 sitokininin ekspresyonu üzerindeki rolünün araştırılması

    LAYKA ABBASİ ASBAGH

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2006

    Biyoteknolojiİzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. FUAT DOYMAZ

    DOÇ. DR. ÇAĞ ÇAL

  5. Tez No

    205091

    Investigating the role of personality and justice perceptions on social loafing

    Kişilik ve adalet algılarının sosyal kaytarma üzerindeki rolünün araştırılması

    HİLAL ESEN ÜLKE

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2006

    PsikolojiOndokuz Mayıs Üniversitesi

    Psikoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ.DR. REYHAN BİLGİÇ

Geri Dön