A brighter method to illuminate the dark side of adhesion g protein-coupled receptors: detection of the ADGRG1 dimers by bioluminescence resonance energy transfer (BRET)
Adezyon g proteinine kenetli reseptörlerin karanlik tarafini aydinlatacak parlak metot: biyolüminesans rezonans enerji transferi (BRET) ile ADGRG1 dimerlerinin gösterilmesi
- Tez No: 688593
- Danışmanlar: DOÇ. DR. ÇAĞDAŞ DEVRİM SON, DR. ORKUN CEVHEROĞLU
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2021
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
G proteine kenetli reseptörler (GPKR), canlı hücrelerde oligomerik yapılar oluşturur ve bu kompleks yapılar reseptörün matürasyonu, trafiği ve sinyalizasyon mekanizmalarını etkiler. GPKR'lerin en büyük ikinci alt-ailesi olan adezyon G proteine kenetli reseptörler de (aGPKR), hücreler arası matriks ve komşu hücre yüzeyinde bulunan ligandlarla doku ve organ gelişimine etki etmek için etkileşime girerler. Fakat, aGPKR'lerin birbirleri ile etkileşime girip girmediği hala belirsizdir. Bu çalışmada, aGPKR'lerin dimerizasyonun canlı hücrelerde Biyolüminesan Rezonans Enerji Transferi (BRET) ile araştırılması için model bir aGPKR olan ADGRG1 kullanılmıştır. BRET donörü (NLuc) ya da akseptörü (EGFP) ile C-terminalindeki çeşitli pozisyonlardan işaretlenmiş ADGRG1 reseptörlerinin HEK 293 hücrelerinde ifade edilmesi sağlanmıştır. İşaretli reseptörlerin hücre içi lokalizasyonları lazer taramalı konfokal mikroskop ile doğrulanmıştır. C-terminalinden işaretli konstraktların hücre içi ifadeleri Western blotlama yöntemi ile belirlenmiş ve konstraktların işlevselliği biyolüminesans temelli Serum Response Element (SRE) Assay ile belirlenmiştir. EGFP ile işaretli bütün ADGRG1 konstraktlarının, WT ve N-terminalinden kesilmiş reseptörlerde olduğu gibi fonksiyonel oldukları gösterilmiştir. NanoLuc (NLuc) ve Renilla luciferase (RLuc)'in ikisi de coelenterazine'i okside ettikleri için, NLuc işaretli ADGRG1 reseptörleri SRE yöntemi ile test edilememiş ancak işaretlemeler aynı bölgeden yapıldığı için daha küçük bir tag olan NLuc ile işaretli reseptörler de fonksiyonel olarak sayılmıştır. ADGRG1 reseptörünün in vivo dimerizasyonunun saptanması için NLuc ile işaretli ADGRG1 konstraktları, EGFP ile işaretli ADGRG1 konstraktları ile birlikte transfekte edilmişlerdir. Etkileşime giren reseptörlerden dolayı meydana gelen BRET ölçülmüştür. C-terminalinden işaretli reseptörler ile karşılaştırıldığında, C-terminalindeki 667'inci amino asiti ardından işaretlenmiş ADGRG1 reseptörlerinde BRET artmıştır. Bu çalışmada belirtilen sonuçlar, aGPKR'lerden biri olan ADGRG1'ın homodimerizasyonuna hatta oligomerizasyonuna ilişkin ilk kez bilgi sağlamaktadır.
Özet (Çeviri)
G protein-coupled receptors (GPCRs) form oligomeric complexes in living cells, and these complex structures affect the receptor maturation, trafficking, and signaling processes. Adhesion G protein-coupled receptors (aGPCRs), the second-largest sub-family of GPCRs, interact with extracellular matrix and ligands on the adjacent cell surface to modulate tissue and organ development. However, it is still unclear whether aGPCRs interact with each other. In this study, ADGRG1 was used as a model aGPCR to investigate the aGPCR dimerization in living cells using Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET). BRET donor (NLuc) or acceptor (EGFP) tagged ADGRG1 receptors at various positions at C-terminus were expressed in HEK 293 cells. The cellular localizations of tagged receptors verified by laser scanning confocal imaging. The expression of C-terminally tagged constructs were determined using Western blot technique and their function was assessed with a bioluminesence based Serum Response Element (SRE) assay. The EGFP-tagged ADGRG1 constructs were all functional with elevated SRE activity as in the case for WT, and N-terminally truncated receptors. Since both NanoLuc (NLuc) and Renilla luciferase (RLuc) oxidize coelenterazine, NLuc-tagged ADGRG1 receptors could not be tested for the function using this method. However, as the tagging position was same and the tag NLuc was smaller in size these constructs were assumed to be functional. Various constructs of ADGRG1 tagged with NLuc were co-transfected with ADGRG1 EGFP constructs to determine the in vivo dimerization of ADGRG1. BRET resulting from the interacting receptor dimers was measured. Observed BRET increased in constructs tagged after 667th amino acid at C-terminus compared to the constructs with NLuc and EGFP appended at the end of C-terminus. The results given herein, suggest for the first time the homodimerization and may be oligomerization of ADGRG1, an aGPCR.
Benzer Tezler
- Investigation of infrared phosphorescence properties of chromium doped lanthanum gallogermanate phosphors sythesized by sol-gel method
Sol-gel yöntemi ile sentezlenen krom katkılı lantan galogermanat fosforlarının kızılötesi fosforesans özelliklerinin incelenmesi
BURCU CAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2020
Mühendislik Bilimleriİstanbul Teknik ÜniversitesiMetalurji ve Malzeme Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ NURİ SOLAK
- Erdemli toplum inşasında Kur'âni metot
Qur'anic method for building a virtuous society
HASAN DERE
Yüksek Lisans
Türkçe
2025
Dinİstanbul Sabahattin Zaim ÜniversitesiTemel İslam Bilimleri Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MURAT KAYA
- Development of nano-alloyed CdTeS quantum dots via two-phase synthesis method
İki faz yöntemiyle nano-alaşım CdTeS kuantum noktacıklarının sentezi
SACİDE MELEK KESTİR
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
Kimyaİstanbul Teknik ÜniversitesiNanobilim ve Nanomühendislik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. CANER ÜNLÜ
- Transforming feedback control systems on whiteboard into Matlab via a deep learning based intelligent system
Derin öğrenme tabanlı akıllı bir sistem ile beyaz tahtadaki geribeslemeli kontrol sistemlerinin Matlab ortamına aktarılması
DORUKHAN ERDEM
Yüksek Lisans
İngilizce
2020
Elektrik ve Elektronik Mühendisliğiİstanbul Teknik ÜniversitesiKontrol ve Otomasyon Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. TUFAN KUMBASAR
- Erik marmelatı üretiminde güncel yöntem: Ohmik ısıtma
Current method in plum marmalada production: Ohmic heating
ŞEYMANUR EKİCİ
Yüksek Lisans
Türkçe
2025
Gıda MühendisliğiMunzur ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. SERDAL SABANCI