Application of high performance liquid chromatography to the purification of restriction enzymes
Yüksek performanslı likit kromotografinin restiksiyon enzim saflaştırmasına uygulanması
- Tez No: 65098
- Danışmanlar: DOÇ. DR. KUTLU ÜLGEN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Kimya Mühendisliği, Chemical Engineering
- Anahtar Kelimeler: DNA restriksiyon enzimleri, Kromatografi, Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı, Saflaştırma, DNA restriction enzymes, Chromatography, Chromatography-high pressure-liquid, Purification
- Yıl: 1997
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Boğaziçi Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
ÖZET Restriksiyon enzimlerinin saflaştırılmasına ilişkin teknolojilerin geliştirilmesi ve iyileştirilmesi konularına, gen mühendisliği alanına ışık tutmak açısından, büyük önem verilmektedir. TaqI restriksiyon enzimi, sıcaklık değişimlerine dayanıklı Thermus Aquaticus hücrelerinden elde edilmekte ve daha çok moleküler alanda kullanılmaktadır. Bu çalışmada, önce BSA saflaştırılması düşük ve yüksek basınçlı kromatografi kolonlarında incelenmiş, daha sonra TaqI saflaştırılması işlemi, yüksek basınçlı likit kromatografilerde, tekli ve ikili kolon sistemlerinde gerçekleştirilmiştir, iyon değiştirici kromatografi olarak, Waters 650 E geliştirilmiş protein saflaştırma sistemi kullanılmış ve ayırma işlemi 280 nm dalga boyunda, Waters 484 Tunable Wavelength detektörüyle takip edilmiştir. Restriksiyon enzimi TaqI, gradyen kazanım metodu ile, 0.1-1 M NaCl içeren tampon (pH 7.4) çözeltinin kolondan geçirildiği bir ortamda geri kazanılmıştır. Aktivite agaroz jel elektroforezi ile, saflık ise SDS-PAGE metoduyla ölçülmüştür. Düşük basınçlı kolonlarda gerçekleştirilen ön çalışmada, kolon performansı; çalışma koşullan (uzunluk, çap, sıcaklık, besleme çözeltisi konsantrasyonu, pH gibi parametreler cinsinden), BSA proteininin DE52 iyon değiştirici üzerinde adsorplanması ortamında incelenmiştir. TaqI endonükleaz enziminin HPLC uygulanmasında ise, kolon çeşitlerinin etkileri, gradyen ve izokratik kazanımlar, hücrelerin büyüme ortamı, kolona besleme miktarı gibi parametrelerin TaqI saflaştırılmasına etkileri incelenmiştir. Test edilen kolonlar arasında, semi-preparatif DEAE anyon kolonu adsorpsiyon ve desorpsiyon kademelerinde iyi bir performans göstermiştir. Gradyen geri kazanımın, gereksiz seyreltme ve uzun ayırma işlemini en aza indirgediği için, izokratik yönteme kıyasla tercih edilebileceği görülmüştür. TYE-Castenholz içinde büyüyen hücrelerden elde edilen TaqI spesifik aktivitesinin, 1.65 kez TYE-NaCl ortamında elde edilenden daha fazla olduğu saptanmıştır. DEAE anyon kolon yükleme kapasitesi, 30 + 2 mg olarak saptanmıştır. 2 gram Thermus Aquaticus hücresinden, iki anyon kolonlu saflaştırma sisteminde, yüzde 42 oranında aktif enzim kazanımı sağlanmıştır.
Özet (Çeviri)
IV ABSTRACT Great attention has been paid to the development and improvement of technologies related to restriction endonuclease downstream processing for the exploitation of genetic engineering. The restriction enzyme TaqI was produced by the thermostable bacterium Thermus aquaticus and used extensively in molecular diagnostics. In the present study, purification of BSA was carried out both by low pressure and high pressure liquid chromatography, while purification of TaqI was carried out by high pressure liquid chromatography using single and double column systems. Ion exchange chromatography was performed on Waters 650E Advanced Protein Purification System. The separation of proteins at 280 nm were monitored with Waters 484 Tunable Wavelength Detector. Gradient elution was used to recover the restriction enzyme TaqI where 0.1-1 M NaCl dissolved in extract buffer, pH 7.4 was passed through the column. The activity and the purity of the enzyme were determined by agarose gel electrophoresis and SDS-PAGE, respectively. The effects of column types, gradient and. isocratic elution, growth media and sample load on the purification of TaqI were investigated. Among the columns tested, the semi-preparative Protein-PAK DEAE weak anion exchange column resulted in good adsorption and elution. For the recovery of TaqI, gradient elution was more preferable when compared to isocratic, because gradient elution required shorter elution times that prevented unnecessary dilution and long separation times. The specific activity of TaqI in TYE-Castenholz medium was determined to be 1.65 times higher than that found in TYE- NaCl medium. The sample loading limit of the anion exchange column was determined to as 30 + 2. Two -step purification system with anion columns yielded 42 percent active enzyme recovery from 2 gram T. aquaticus cells which were grown in TYE-Castenholz medium.
Benzer Tezler
- Fenollerin sulu çözeltilerden orgono kil üzerinde adsorpsiyon ile zenginleştirilmesi ve kapiler elektroforez yöntemi ile tayini
Preconcentration of phenols from aqueous solutions by adsorption on organo-clay followed by capillary electrophoretic determination
İNCİ ALEMDAR
- Ebselen, 2-fenil-1,2-benzisoselenazol-3(2H)-on için miktar tayini yöntemi geliştirilmesi ve tablet formunda uygulanması
The Method development for determination for ebselen, 2-phenyl-1,2-benzisoselenezole-3(2H)one and the application of the method to the tablet form
ŞEBNEM YILMAZ
Doktora
Türkçe
2001
Eczacılık ve FarmakolojiMarmara ÜniversitesiAnalitik Kimya Ana Bilim Dalı
Y.DOÇ.DR. GÜLER YALÇIN
- Hemoglobinlerin HPLC yöntemi kullanılarak incelenmesi
Başlık çevirisi yok
EROL ÖMER ATALAY
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
1988
BiyokimyaÇukurova ÜniversitesiBiyokimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. GÜNEŞ YÜREGİR
- Serbest idrar katekolaminlerinin yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile ölçümü ve klinik tanıdaki yeri
Başlık çevirisi yok
GÜNGÖR YILDIRIM
- Alifatik diaminlerin ve suda çözünen yaygın fenollerin yüksek basınç sıvı kromatografisi ile ayırımı ve UV-görünün spektrofotometrik tayinleri
Determination of aliphatic diamines and common phenols in water by using HPLC with UV-visible detection
ADEM ASAN