Purification of casein kinase II from sheep lung tissue and kinetic characterization using MYC oncoproteins as sustrate
Koyun akciğer dokusundan kazein kinaz II`nin saflaştırılması ve MYC onkoproteini substratı ile kinetik karakterizasyonu
- Tez No: 48103
- Danışmanlar: PROF. DR. WAYNE E. CRİSS
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyokimya, Biochemistry
- Anahtar Kelimeler: Kazein kinaz II, myc onkoprotein, poliaminler, poliamin analoglar, Genler-MYC, Kazeinler, Onkogen proteinleri, Onkogenler, Casein Kinase II, oncoprotein, polyamines, polyamine analogs, Genes-MYC, Caseins, Oncogene proteins, Oncogenes
- Yıl: 1996
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Hacettepe Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyokimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
ÖZET Kazein kinaz II (CKII) enzimi bir çok prokaryot ve ökaryot hücresinde bulunan bir protein kinazdır. Heterotetramer yapısında olup 2 alfa ve 2 beta alt birimi içermektedir. Enzimin farklı izoformları olduğu gibi, halka yada iplik yapısında olan farklı moleküler biçimleri de bulunmaktadır. CKII enzimi doğal yolla oluşan, konsantrasyonları hem hızla çoğalan hücrelerde hem de kanser hücrelerinde artan poliaminler tarafından stimüle edilmektedir. 100' den fazla substratı olan enzimin aktivitesi hücrelerin çoğalmaları esnasında artmaktadır.DEAE-sellüloz, sefaroz CL-6B ve poli-L-lizin affinite kromatografisi gibi teknikler kullanarak CKH enzimi koyun akciğerinden saflaştınldı. Saflaştırma basamaklannda kazein substrat, GTP ise fosfat vericisi olarak kullanıldı. Kinetik özelliklerinin saptanmasında ise c-myc onkogen ürünü olan myc onkoproteini (pmyc) substrat, fosfat vericisi olarak ta GTP kullanıldı. Yaklaşık olarak 550 kez saflaşmış olan CKII enziminin son özgül aktivitesi 800,000 U/mg protein idi. Stimulator olarak polilizin yokluğunda, substrat olarak ta pmyc kullanıldığında enzimin GTP için görünür Km ve Vmax'i 3.3 uM ve 6,250 U/mg protein, pmyc için ise görünür Km ve Vmax 0.2 uM ve 9,433 U/mg protein olarak saptandı. Dolayısıyla, CKII enzimi için myc onkoproteini mükemmel bir substrat olarak gözükmektedir. Stimulator varlığında ise GTP için saptanan Km ve Vmax 8.2 uM ve 14,000 U/mg protein iken, pmyc için ise görünür Km ve Vmax 0.5 uM ve 100,000 U/mg protein olarak hesaplandı. Enzim spermidin ve spermin varlığında % 700 ve % 1100 stimüle, dekstran sülfat varlığında ise % 95 inhibe oldu. Bu çalışmada ayrıca CKII enzimi üzerindeki etkilerini belirlemek amacıyla 5 farklı anti-kanser poliamin analogu çalışıldı. Son zamanlarda bu analoglar ABD' de klinik çalışmalarda kullanılmaktadır. Bu analoglardan sadece BESpm ve BE4x4, CKII enzimini % 85 ve % 80 olarak inhibe etti. Çalışmalarımız CKII enziminin poliaminler tarafından stimüle, dekstran sülfat ve belli poliamin analogu olan ilaçlar tarafından inhibe edildiğini, göstermiştir. Dolayısıyla, bu veriler gelecekte farklı kanser türleri için klinik çalışmalarda kullanılabilir.
Özet (Çeviri)
SUMMARY Casein kinase II (CKII) is a protein kinase that has been found in most types of prokaryotic and eukaryotic cells. It is a heterotetramer composed of 2 alpha and 2 beta subunits. It also has different isoforms. It can be found in several molecular shapes including ring-like or filament structures. CKII is stimulated by naturally occuring polyamines whose concentrations increase in rapidly proliferating normal and cancer cells; and it is inhibited by polyanionic carbohydrate molecules. It phosphorylates more than 100 protein substrates. The activity of the enzyme is increased during cellular proliferation.We purified CKQ from sheep lung tissue by using DEAE-cellulose, sepharose CL-6B and poly-L-lysine affinity chromatographic techniques. The enzyme was purified using casein as substrate and GTP as the phosphate donor. It was characterized kinetically using the myc oncoprotein (pmyc) as substrate and GTP as the phosphate donor. CKQ was purified approximately 550 fold with a final specific activity near 800,000 U/mg protein. In the absence of polylysine as stimulator, the KmapP and Vmax app for GTP were 3.3 uM and 6,250 U/mg protein with pmyc as substrate (the protein product of myc oncogene) and the Krriapp and Vmax app for pmyc were 0.2 uM and 9,334 U/mg protein. This shows that pmyc is an excellent substrate for CKII. In the presence of stimulator, the Km^p and VmaxaPP for GTP and pmyc were 8.2 uM, 14,000 U/mg protein and 0.5 uM, 100,000 U/mg protein. The purified enzyme was stimulated 700 % and 1100 % with spermidine and spermine respectively. It was inhibited approximately 95 % by dextran sulphate.We studied 5 different anti-cancer polyamine analogs to determine their effects on the CKII. BESpm and BE4x4 inhibited polyamine stimulated CKII 85 % and 80 %, respectively. Our studies show that CKII is stimulated by polyamines and inhibited by dextran sulphate and certain polyamine analogue drugs. Such information can be used in clinical trials for different cancers in the future.
Benzer Tezler
- Düşük molekül ağırlıklı polipeptidlerin poliakrilamid jel elektroforeziyle ayrılması
Seperation of the low molecular weight polypeptides with polyyacrylamide gel electrophoresis
İSMAİL KILIÇ
- Süne (Eurygaster spp.) proteolitik enzimlerinin izolasyonu, karakterizasyonu, saflaştırılması ve gluten proteinleri üzerine etkilerinin belirlenmesi
Isolation, characterization, purfication of wheat bug (Eurygaster spp.) proteases and determination of its effects on gluten proteins
DİLEK SİVRİ
Doktora
Türkçe
1998
Gıda MühendisliğiHacettepe ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. HAMİT KÖKSEL
- Aktif çamurda çoklu substrat gideriminin modellenmesi
Modelling of multiple substrate removal in activated suludge process
GÜLEN EREMEKTAR
Doktora
Türkçe
1997
Çevre Mühendisliğiİstanbul Teknik ÜniversitesiÇevre Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. OLCAY TÜNAY
