Geri Dön

Optimization of cultivation conditions and engineering by random mutagenesis for high lipid production in Schizochytrium sp. S31

Schizochytrium sp. S31'in üretim koşullarının iyileştirilmesi ve rastlantısal mutasyon ile geliştirilmesiyle yüksek oranda lipid eldesi

PDF İndir

  1. Tez No: 450950
  2. Yazar: NURCAN VARDAR
  3. Danışmanlar: DOÇ. DR. NEVİN GÜL-KARAGÜLER, PROF. MELEK TÜTER
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Deniz Bilimleri, Biyoteknoloji, Genetik, Marine Science, Biotechnology, Genetics
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2016
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

Schizochytrium sp. yüksek oranda çoklu doymamış yağ asitleri özellikle dokosaheksaenoik asit (DHA) elde etmek amacıyla yaygın olarak çalışılan mikroalgdir. Farmasötik hammadde, gıda katkısı, su kültürü ve hayvan yemi olarak kullanılan çeşitli biyoaktif bileşikler içerirler. Ayrıca alternatif enerji kaynağı olarak kullanılan biyoyakıt üretiminde önemli role sahiptir. Hızlı büyüyen ve yüksek DHA oranına sahip Schizochytrium sp. balık yağına alternatif olarak kullanılabilir. Bu çalışmada, Schizochytrium sp. S31 mikroalginin toplam biyokütle ve yağ oranını artırmak amacıyla hücre büyüme koşullarının tepki yüzey metodu ile optimizasyonu gerçekleştirilmiştir. Optimize edilen büyüme koşulları kullanılarak Schizochytrium sp. S31'in büyük hacimde üretimi gerçekleştirilmiş ve yüksek oranda yağ elde etmek amacıyla hücre parçalama, kurutma ve yağ ekstraksiyonu içeren akış proseslerinin karşılaştırılması ve optimizasyonu tamamlanmıştır. Son bölümde, ultraviyole (UV) ışın veya kimyasal mutajen kullanarak rastlantısal mutasyon uygulaması ve floresan sitometri yöntemiyle yüksek oranda yağ üreten Schizochytrium sp. mutantın seçilimi gerçekleştirilmiştir. Schizochytrium sp. üretimini besiyeri içeriği, pH, tuzluluk ve sıcaklık gibi birçok faktör etkileyebilir. Çoklu doymamış yağ asitlerinin insan sağlığı, endüstriyel ve ticari kullanımında önemli bir rol oynamasından dolayı biyokütle ve lipid üretiminin geliştirilmesi üzerindeki çalışmalar son zamanda artmıştır. Bu sebeple, besiyeri içeriği ve çevresel koşulların optimizasyonu, organizmanın biyokütlesinin ve toplam lipid içeriğinin geliştirilmesi için önemlidir. İstatistiksel yaklaşımlar, biyokütle üretim ve yağ ekstraksiyon optimizasyonu için uygun bir yol olmakla birlikte ürün verimliliğini artırarak üretim maliyetini düşürmüştür. Plackett burman ve merkezi kompozit tasarım gibi istatistiksel metotlar, çeşitli faktörleri ve onların birbiriyle etkileşiminin optimizasyonunda yaygın olarak kullanılmıştır. Plackett Burman tasarımı, biyoproseslerin optimizasyonunda belirlenen cevaplara etki eden faktörlerin tanımlanmasında ilk adım olarak kullanılır. En önemli faktörlerin seçimini takiben merkezi kompozit tasarımlı tepki yüzey yöntemi, bu faktörlerin optimum değerlerini tespit etmek amacıyla kullanılır. İstatistiksel analiz sonuçlarına göre, maksimum biyokütle (26.86g/L) üretimi, 2.29 g/l monosodyum glutamat (MSG), pH 5.8 yetiştirme koşulları ile elde edilmiştir. Maksimum lipid (% 35) üretimi 0.49 g.L-1 MSG, 17.6 °C sıcaklık koşullarında elde edilmiştir. Schizochytrium sp. S31, şeker, organik asitler ve alkol gibi alternatif hammaddeler kullanılarak biyoreaktörde heterotrofik olarak üretilebilir. Bu sebeple heterotrof sistemler, alternatif substratlar kullanarak yüksek kalitede büyük ölçekli DHA üretilmesinde uygun maliyetli bir yoldur. Yüksek hacimde heterotrofik üretim teknolojileri, kirlilik riski ve üretim maliyetini düşürmüş, ışık kısıtlaması olmaksızın yüksek oranda proses kontrolü ve yeniden üretilebilirlik sağlamıştır. Birçok durumda, heterotrof mikroalg kültürü ışık kısıtlaması ve kontrol edilebilirliği sayesinde fototrof kültüre göre daha yüksek hücre yoğunluğu ve lipid verimliliği sağlamıştır. Yüksek hacimde üretim sonuçlarına göre, başlangıç üreme hızı 0.312 h-1 olan 65g/l kuru hücre ağırlığı elde edilmiştir. Karbon azot oranı (C/N) 19.32 olarak hesaplanmıştır. Optimize edilen koşulların uygulanması sonucunda kuru hücre ağırlığının %27.5'i oranında lipid elde edilmiştir. 5 litre biyoreaktörde üretilen Schizochytrium sp. kültüründen %30.18 oranında DHA elde edilmiştir. Biyokütle, lipid ve DHA üretim verimlilikleri sırasıyla 0.65 g/l.h, 0.17g/l.h ve 0.053g/l.h olarak hesaplanmıştır. Büyük hacimde üretim tamamlandıktan sonra istenilen ürünün hücre kütlesinden belirli aşamalarla ayrılarak saflaştırılması işlemi gerçekleştirilir. Bu saflaştırma işlemleri hasat alma, su giderme, hücre parçalanması ve lipid ekstraksiyon işlemlerini içermektedir. Mikroalg kültürünün hasadı, biyokütle konsantrasyonunu arttırmak için santrifüj, filtrasyon ve çöktürme yöntemlerini içerir. Kurutma aşaması, su giderme işlemi olarak da bilinir ve hücre peletleri tamamen sudan uzaklaştırılmış olur. Lipid ekstraksiyonun verimliliğini arttırmak ve ayrıca maliyeti düşürmek için hücre peleti kurutma işlemine maruz bırakılır. Hücre parçalanması, lipid ekstraksiyonun veriminde anahtar bir rol oynamaktadır. Sonikasyon, yüksek basınçlı homojenizatörler, öğütme, enzimatik reaksiyonlar ve kimyasal hidroliz mikroalgler için yaygın olarak kullanılan hücre parçalama yöntemleridir. Mikroalg lipid ekstraksiyonu için literatürde farklı türde solvent ve ekstraksiyon yöntemleri kullanılmıştır. Genellikle hekzan, metanol, etanol ve izopropanol lipid ekstraksiyonu için kullanılan solventlerdir. Hücre parçalama ve lipid ekstraksiyon sonuçlarına göre, hekzan ile birlikte uygulanan ultrasonikasyon metodu toplam lipid oranını önemli ölçüde artırmıştır. Sonikasyon metodu uygulanarak toplam lipid oranı 1.4 kat artırılmıştır. Bununla birlikte, geleneksel lipid ekstraksiyon yöntemleri yüksek oranda toksik solvent kullanmaktadır. Süperkritik akışkan ekstraksiyonu genellikle solvent olarak yüksek basınçta karbondioksit kullanarak yüksek seçicilikle lipid ve/veya nutrasötik ürünlerin ekstraksiyonu için kullanılır. Süperkritik akışkan ekstraksiyonun süre, sıcaklık ve basıncın yağ verimi ve %DHA üzerindeki etkisi tepki yüzey metoduyla tespit edilmiştir. Süperkritik akışkan ekstraksiyonu sonuçlarına göre, basınç ve sıcaklık toplam lipid verim ve DHA konsantrasyonu üzerinde önemli etkiye sahiptir (p <0.05). Sabit sıcaklıkta, basınç arttıkça lipid ve DHA verimi artarken sabit basınçta sıcaklık arttıkça lipid ve DHA verimi azalmaktadır. İstatistiksel kontur analizlerine göre, optimum koşullar 425bar basınç, 40.5°C ve 97.5 dakika olarak tespit edilmiştir. SFE koşullarının optimizasyonu sonucu %30.2 yağ verimi elde edilmiştir. Yüksek yağ içeriğine sahip mikroalg mutantlarının flow sitometri yöntemiyle seçilimi, genoma rastlantısal mutasyon tanıtımı ile gerçekleşebilir. Rastlantısal mutasyon için genel olarak iki mutajen uygulanmaktadır: UV radyasyon ve kimyasal mutajen. Her iki yöntemde mikroalgler ile ilgili genetik bilgiye gereksinim duyulmaz. Floresan aktif hücre ayırma, istenilen fenotipte mutant seçiminde yüksek verimlilik sağlamaktadır. Bu çalışma ile Schizochytrium sp. mikroalginin lipid üretiminin artırılmasında UV mutasyonu ve flow sitometre bazlı seçilimin uygulanabilir bir yaklaşım olabileceği gösterilmiştir. Azot (N), fosfor (P) gibi besin kısıtlayıcı ve sıcaklık sınırlayıcı koşullar, Schizochytrium sp.'nin lipid içeriğinde önemli bir artışa sebep olmuştur. Karakterizasyon sonuçlarına göre, 30 saniye UV ışınına maruz kalmış mutantlar yabanıl tipe göre daha hızlı lipid biriktirmektedir. Mutantlar ve yabanıl tip arasındaki lipid biriktirme profili farkını anlayabilmek için sürece bağlı deneyler uygulanmıştır. Sonuçta, toplam yağ oranı Mutant1'de %28.4, Mutant2'de ise %10.8 oranında artmıştır. Gaz kromatografisi kütle spektrometresi analizlerinden elde edilen sonuçlar flow sitometriden elde edilen sonuçlarla tutarlılık göstermekte olup 30 saniye boyunca UV'ye maruz kalmış kültürlerin DHA oranında artış olduğu gözlemlenmiştir. Yabanıl tip ile diğer iki mutant karşılaştırıldığında DHA oranında sırasıyla %17.9 ve %12.1 oranında artış gözlemlenmiştir.

Özet (Çeviri)

Schizochytrium sp. is widely studied microalgae to obtain high content of polyunsaturated fatty acids especially docosahexaenoic acid (DHA). They contain various bioactive compounds that can be used as pharmaceutical raw material, food additive, aquaculture and animal feed. They also play a crucial role in biofuel production which can be used as an alternative energy source. Schizochytrium sp. which is grown rapidly and produced high amount of DHA can be used as an alternative to fish oils. In this study, cultivation conditions were optimized to increase biomass and total lipid productivity of the Schizochytrium sp. S31 by using response surface methodology. After optimizing growth conditions, large scale production of Schizochytrium sp. S31 under favorable conditions were performed and downstream process including cell lysis, drying and lipid extraction were compared and optimized to maximize total lipid specially DHA extracted from Schizochytrium sp. S31. Finally, random mutation was applied by ultraviolet (UV) radiation or chemical mutagen and high yield of lipid accumulating mutants of a Schizochytrium sp. were selected by flow cytometric-based selection. Many factors may affect the cultivation conditions of Schizochytrium sp. such as medium composition, pH, salinity and temperature. Since polyunsaturated fatty acids have gained significance due to their role in human health, industrial and commercial usage, research on enhancement of biomass and lipid production has increased. Therefore, optimization of medium composition and environmental conditions to improve biomass and total lipid content of the organism is important. Applying a statistical strategy was an effective tool for optimization of the production and extraction process, which would also reduce the production costs through maximizing the yield. Statistical methodologies such as Plackett burman and central composite design have been extensively used to optimize several factors and their interactions. Plackett burman design was used recently as the first step in optimizing different bioprocesses to identify the factors with a significant effect on desired responses. Following the selection of the most significant factors, response surface methodology with central composite design is used to determine the optimum values of these factors. Based on contour plots and canonical analysis, a maximum biomass production of 26.86g·L-1 was obtained with 2.29 g.L-1 monosodium glutamate (MSG), pH 5.8 cultivation conditions. Maximum lipid production of 35% was obtained with 0.49 g.L- 1 MSG at 17.6 °C temperature conditions. Schizochytrium sp. S31 can be grown heterotrophically in bioreactor by supplying with alternative raw materials such as sugars, organic acids and alcohols. Thus, heterotrophic systems assure a cost effective way to obtain valuable microalgae produced DHA by using cheap substrates on large scale. Large scale heterotrophic growth technologies has lower contamination risk, lower harvesting costs, eliminated light limitation, high degree of process control and reproducible. In most instances, heterotrophic culture commonly results in much higher cell densities and lipid productivity than phototrophic culture because there is no light limitation in heterotrophic culture and controllable. According to large scale production results, 65 g/l of cell dry weight with the initial growth rate of 0.312 h-1 was obtained. C/N ratio of the Schizochytrium sp. culture was calculated as 19.32. The total lipid content was 27.5 % of the cell dry weight after applying optimized conditions. DHA percentage of the Schizochytrium sp. culture in 5 liter was calculated as 30.18%. Biomass, lipid and DHA productivity was calculated as 0.65 g/l.h, 0.17g/l.h and 0.053g/l.h respectively. Downstream processing steps required to obtain lipid from microalgal biomass once large scale production process is completed. Downstream process include harvesting, dewatering, cell disruption, lipid extraction. Harvesting microalgal culture includes centrifugation, filtration, and flocculation methods to concentrate microalgal culture. Drying step is known as post-dewatering step in which the cell pellet is completely dewatered. The cell pellet is exposed drying process for enhancing the efficiency of subsequent lipid extraction and lowering the cost of downstream process. Cell disruption is a key step in influencing lipid extraction yields. Sonication, high-pressure homogenizers, grinding, enzymatic reactions, chemical hydrolysis are the most known cell disruption methods applied for microalgae. Different types of solvents and extraction methods have been used in the literature to recover microalgal lipids. Hexane, methanol, ethanol, isopropanol are the typical solvents used for lipid extraction. According to the cell lysis and lipid extraction results, ultrasonication with hexane method increased the total lipid yield significantly with clear appearance. Sonication resulted in a 1.4-fold increase in lipid yield when compared with solvent alone. However, these traditional lipid extraction methods use large amounts of solvents that are mostly toxic. Supercritical liquid extraction (SFE) generally uses carbondioxide as a solvent at high pressure to extract lipid and/or nutraceutical products with higher selectivity in shorter extraction times. The effect of extraction temperature, pressure and time of SFE on the lipid yield and %DHA amount were investigated by using RSM. According to SFE results, pressure and temperature have significant effect (p <0.05) on total lipid yield and DHA concentration. Based on contour plot analysis, optimum extraction conditions were found to be 425 bar pressure at 40.5°C for 97.5min. After optimization of pressure, temperature and time variables of SFE, 30.2% lipid yield was obtained. Isolation of high yield lipid accumulating mutants of microalgae by flow cytometricbased selection can be performed by introducing mutations in the genome. There are mainly two mutation agents for random mutagenesis: UV radiation and chemical mutagenizing agent. Both methods do not require any genetic information about microalgae. Fluorescent activated cell sorting is a high throughput technique for selection of mutants with desired phenotype. This study highlighted that UV mutagenesis and high throughput selection improved lipid productivity in Schizochytrium sp. S31. Nutrient limitation conditions, such as nitrogen (N), phosphorus (P) starvation, and temperature limitation induced lipid accumulation in Schizochytrium sp. According to characterization results, mutants which were treated to UV for 30 second accumulate lipid faster than wild type. Time course experiment were conducted to understand the lipid accumulation profile difference between mutants and wild type. Total lipid was increased by 28.4 % for Mutant1 and 10.8% for Mutant2 comparing to wild type. The results obtained from gas chromatography mass spectrometry analyses confirmed the results obtained by flow cytometry, showing an increase in DHA in UV treated cultures (30sec) compared to untreated controls. There was a 17.9% and 12.1% increase compare to wild type in terms of DHA percentage in two different mutants respectively.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    465407

    Optimization of Production Parameters for Single Cell Oil and Metabolite Production from Yarrowia lipolytica Strains

    Yarrowia lipolytica Suşlarından Tek Hücre Yağı ve Metabolit Üretim Parametrelerinin Optimizasyonu

    AYŞE SAYGÜN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2017

    Gıda Mühendisliğiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. NEŞE ŞAHİN YEŞİLÇUBUK

    PROF. DR. NECLA ARAN

  2. Tez No

    662696

    Discovery of novel enzymes using proteomic approaches

    Proteomik yaklaşımlar kullanılarak yeni enzimlerin keşfi

    MERVE ÖZTUĞ KILINÇ

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2021

    Biyokimyaİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)

    PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER

    DOÇ. DR. MÜSLÜM AKGÖZ

  3. Tez No

    797200

    Doğrusal programlama yöntemiyle seralarda enerji kaynağı çeşitlendirme optimizasyonu

    Diversification of energy sources optimization in greenhouses with linear programing method

    SEMİH GENCER

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    Elektrik ve Elektronik MühendisliğiHarran Üniversitesi

    Elektrik-Elektronik Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ NURETTİN BEŞLİ

  4. Tez No

    328166

    Aşırı asidik ortamlarda prokaryotik çeşitliliğin geleneksel ve moleküler yöntemlerle belirlenmesi ve biyodesülfürizasyonda kullanılabilirliği

    Determination of prokaryotic diversity in extreme acidic environments with conventional and molecular methods and usability at biodesulphurization

    PINAR AYTAR

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2012

    MikrobiyolojiEskişehir Osmangazi Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. AHMET ÇABUK

  5. Tez No

    176916

    Optimization of mannanase production from recombinant Aspergillus sojae and analysis of Galactomannan hydrolysis

    Rekombinant Aspergillus sojae de mannanaz üretiminin optimizasyonu ve Galaktomannan hidroliz analizi

    BENGÜ ÖZTÜRK

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2008

    Gıda MühendisliğiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. UFUK BAKIR

    PROF. DR. ZÜMRÜT BEGÜM ÖGEL

Geri Dön