Termofilik Geobacillus caldoxylosilyticus TK4 rekombinant fosfotriesteraz homolog proteininin mutasyonla bazı özelliklerinin geliştirilmesi
Development of some properties of recombinant phosphotriesterase homology protein obtained from thermophilic geobacillus caldoxylosilyticus TK4 by mutation
- Tez No: 430366
- Danışmanlar: PROF. DR. AHMET ÇOLAK
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Kimya, Genetik, Biyokimya, Chemistry, Genetics, Biochemistry
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2016
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Karadeniz Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Kimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
TÜBİTAK, 109T985 nolu proje kapsamında gerçekleştirilen bu çalışmada, pET-28a(+) vektörüne klonlanmış olan Geobacillus caldoxylosilyticus TK4 fosfotriesteraz homolog protein geni (TK4PHP) üzerinde bölge spesifik mutasyonlar yapıldı. Elde edilen mutant genler Escherichia coli (E. coli) BL21(DE3)pLysS konakçı hücresinde ekspres edilip, saflaştırıldı. Protein ekspresyonu ve saflaştırma işlemi, SDS-poliakrilamid jel elektroforezi yapılarak doğrulandı. Aktivite tayini çalışmalarında genel fosfotriesteraz (PTE) substratlarından paraokson, paratiyon ve malatiyon varlığında herhangi bir aktivite elde edilemezken, denenen esteraz substratları içinde en yüksek aktivite p-nitrofenil asetat (pNPA) varlığında gözlendi. TK4PHP rekombinant enzimi, TK4PHPM3-M4 ve TK4PHPM3-M4-M5 mutat enzimleri için optimum pH 8,0 olarak bulunurken, TK4PHPM3 mutantı için bu değer 8,5 olarak belirlendi. Optimum sıcaklık değerlerinin TK4PHP, TK4PHPM3-M4 ve TK4PHPM3-M4-M5 için 50 °C, TK4PHPM3 için ise 60 °C olduğu görüldü. Km ve Vmax değerleri sırasıyla TK4PHP için 1,27 mM ve 7,59 U/mg protein, TK4PHPM3 için 1,43 mM ve 14,53 U/mg protein, TK4PHPM3-M4 için 0,59 mM ve 3,34 U/mg protein, TK4PHPM3-M4-M5 için ise 0,46 mM ve 4,04 U/mg protein olarak hesaplandı. Rekombinant ve mutant PHP'lerin 4 °C'de, pH 3,0-9,0 aralığındaki tamponlarda ayrı ayrı 7 gün inkübe edilmesiyle, aktivitelerini büyük oranda koruduğu gözlendi. Mutant TK4PHPM3-M4-M5 enziminin, 90 °C'de 7 gün inkübasyon sonunda aktivitesini %75 oranında koruduğu belirlendi. Bu sonuçlar, TK4PHP'sine yapılan mutasyonlarla birlikte, oldukça pH ve ısıl kararlı yeni mutant PHP'lerin endüstriyel uygulamalar için önemli potansiyele sahip olabileceğini göstermektedir.
Özet (Çeviri)
In this study, supported by TUBITAK (Project number is 109T985), site specific mutations in the G. caldoxylosilyticus TK4 PHP gene cloned into pET-28a(+) vector was performed, mutant genes were expressed in E. coli BL21(DE3)pLysS and the mutant proteins were purified. Protein expression and purification were confirmed by SDS-PAGE. Whereas the enzyme did not have any activity in the presence of PTE substartes; paraoxon, parathion and malathion, the highest activities were observed with pNPA as an esterase substrate. The optimum pH were determined to be 8,0 for TK4PHP, TK4PHPM3-M4, TK4PHPM3-M4-M5 and 8,5 for TK4PHPM3. The recombinant TK4PHP and the mutant TK4PHPM3-M4, TK4PHPM3-M4-M5 enzymes exhibited optimum activity at 50 °C and TK4PHPM3's activity was optimal at 60 °C. Km and Vmax values were calculated as 1.27 mM and 7.59 U/mg protein for TK4PHP, 1.43 mM and 14.53 U/mg protein for TK4PHPM3, 0.59 mM and 3.34 U/mg protein for TK4PHPM3-M4 and 0.46 mM and 4,04 U/mg protein for TK4PHPM3-M4-M5, respectively. When the enzymes were separately incubated at 4 °C in the buffer solutions (pH ranging from 3,0- 9,0) for 7 days, the activity was mainly retained. The TK4PHPM3-M4-M5 mutant enzyme retained about 75% of its original activity after 7 days of incubation at 90 °C. It is clear from the present results that the enzymes, which are mutated from TK4PHP showing an extremely pH- and thermo- stable esterase activity, might have a very important potential for industrial applications.
Benzer Tezler
- A Study on compost production possibilities from solid waste of the city of Bursa
Başlık çevirisi yok
RİFAT GÖKSU
Yüksek Lisans
İngilizce
1987
Çevre MühendisliğiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiÇevre Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. SELÇUK SOYUPAK
- Arıtma çamuru ve konsantre organik atıkların aerobik termofilik stabilizasyonu
Başlık çevirisi yok
AYŞE FİLİBELİ
Doktora
Türkçe
1988
Çevre MühendisliğiDokuz Eylül ÜniversitesiÇevre Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. İBRAHİM ALYANAK
- Zeytinyağı endüstri atıksularının anaerobik biyolojik stabilizasyon yöntemi ile arıtılması ve kinetik model geliştirilmesi
Başlık çevirisi yok
ERSİN KASIRGA
- Şekerlemelerde kullanılan boyaları ile mikroorganizma yüklerinin saptanması üzerinde bir araştırma
Başlık çevirisi yok
GÜLNUR FEHMİYE BİRİCİK
Yüksek Lisans
Türkçe
1989
Gıda MühendisliğiUludağ ÜniversitesiTarım Ürünleri Teknolojisi Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. FİKRİ BAŞOĞLU
- DNA repair and genetic transformation in thermus thermophilus HB8
Thermus thermophilus HBB'de DNA onarımı ve genetik transformasyon
NURAY RÜSTEMOĞLU