Modifications on protein termini of Bacillus thermocatenulatus lipase and their impacts on activity and stability
Bacillus thermocatenulatus lipazı protein uçlarının modifikasyonu ve bu modifikasyonların aktivite ve stabiliteye olan etkisi
- Tez No: 389503
- Danışmanlar: PROF. OSMAN UĞUR SEZERMAN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyomühendislik, Biyoteknoloji, Biyoloji, Bioengineering, Biotechnology, Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2014
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Sabancı Üniversitesi
- Enstitü: Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Bacillus thermocatenulatus lipazı (BTL2) üç boyutlu yapısı bilinen (PDB ID: 2W22) termokararlı bir enzimdir. Amino ve karboksi uçları birbirinden oldukça uzakta bulunan diğer lipaz yapılarına kıyasla Bacillus thermocatenulatus lipazının amino ve karboksi uçları birbirine yakın bir mesafede (<5 Å) bulunmaktadır. Dairesel protein omurgasına sahip diğer proteinler için protein uçlarının birbirine yakınlığının termal stabiliteye olan katkısı gösterilmiştir. Bu açıdan yola çıkarak, bu tez protein uçlarının lipaz stabilitesine olan etkisini araştırmaktadır. Bu araştırma için N7G, N7Q ve R5C-A6C-N5C-S386C-L387C-R388C olarak üç farklı BTL2 mutantı kullanılmıştır. BTL2'nin protein omurgası ucundaki en yakın teması yan zincirdeki N7 ve ana zincirdeki L387 rezidüsü arasındaki hidrojen bağı oluşturmaktadır. N7G ve N7Q mutasyonlarında hidrojen bağının etkisi araştırılırken, diğer mutasyonda ise amino ucundan ardışık üç rezidü (5-6-7) ve karboksi ucundan ardışık üç rezidü (386-387-388) sistein amino asitine çevrilerek uçlar arası disülfit bağı kurulması amaçlanmıştır. BTL2 ile birlikte üç mutant BTL2 proteini, protein mühendisliği rutin yöntemlerinden olan yönlendirilmiş mutagenez, ligasyondan bağımsız klonlama, heterolog protein ekspresyonu ve afinite purifikasyonu kullanılarak yüksek saflıkta elde edilmiştir. Doğal BTL2 ve mutant proteinlerin termoaktivite, termostabilite ve subsrat seçiciliği profilleri enzim aktivite analizleri ile karakterize edilmiştir. Ayrıca bütün lipazların ikincil yapıları ve erime sıcaklıkları CD spektroskopi yöntemi ile belirlenmiştir. Sonuçlar, üç mutasyonun da termostabiliteye, termoaktiviteye ve subsrat seçiciliğine büyük bir etkisi olmadığı yönündedir. Ayrıca protein uç kısmındaki hidrojen bağı mutasyonlarının, protein bütünlüğüyle ve protein aktif bölgesinin termal stabilitesiyle ilgisi olmadığı gösterilmiştir. Hidrojen bağı mutasyonlarından farklı olarak üçüncü mutant, BTL2'nin termoaktivitesini ve termal stabilitesini düşürmüştür. Bu bulgu, protein ucundaki sistein amino asitlerinin aktif bölge ve lipaz yapısının destabilizasyonuna neden olduğunu göstermektedir. Optimum stabiliteye sahip protein analogları üretmek gibi protein omurgasında yapılan modifikasyonların olası etkileri düşünüldüğünde, bu tez protein uçlarındaki modifikasyonların lipaz karakteristiğine olan etkisini analiz etmeyi amaçlamıştır. Genel olarak, protein uçlarındaki modifikasyonlar protein aktif bölgesini etkilemeden optimum özelliklere sahip lipaz değişkenleri üretmek için kullanışlı olacaktır.
Özet (Çeviri)
Bacillus thermocatenulatus lipase (BTL2) is a thermostable enzyme with a known three dimensional structure (PDB ID: 2W22). The N- and C- termini of protein backbone in this structure seated very close to each other (<5 Å), unlike to other lipase structures having their termini located fairly apart from each other. For other proteins that possess circular backbone, the close proximity of the protein termini has been shown to contribute to thermal stability. From this perspective, the protein termini and particularly its impacts on lipase stability are investigated in this thesis. During these investigations, three BTL2 variants are used and explicitly these are N7G, N7Q and R5C-A6C-N5C-S386C-L387C-R388C. The closest contact of the backbone termini is a hydrogen bond formed by the side chain of 7th asparagine and the main chain of L387. In the first two mutations N7G and N7Q, the impact of this hydrogen bond is investigated, while in the third mutation three consecutive residues from the N-terminus (5-6-7) and from the C-terminus (386-387-388) are substituted with cysteines aiming to induce a disulfide bond in the third mutant. Along with the native BTL2, three mutants are obtained in high purity via application of various molecular biology and protein engineering routines including site-directed mutagenesis, ligation-independent cloning, heterologous protein expression and affinity purification methods. The native BTL2 and the mutants are subsequently characterized in enzyme activity assays to determine their thermoactivity, thermostability and substrate selectivity profiles. Furthermore the far-UV circular dichorism (CD) spectra are collected for all lipases to analyze their secondary structure and melting temperatures. The results indicated that all three mutations did not have any significant effects on thermal stability, thermoactivity and substrate selectivity of native BTL2 suggesting that the modification of the hydrogen bond at the lipase termini is not related to the integrity and thermal stability of the catalytic domain. Different from the hydrogen bond mutants, the third mutant showed significant decrease in the thermoactivity and thermal stability of the native BTL2. This particular finding suggested that the cysteine substitutions at the termini caused destabilization of the active site and overall structure of the lipase. Considering the possible implications of the modification of the protein backbone such as generation of protein analogues with optimal stabilities, this thesis aimed to analyze the impacts of the modifications of the termini on the lipase characteristics. Overall, it has been concluded that such modifications of the termini would be useful in generation of lipase variants with optimal features without affecting the core domains.
Benzer Tezler
- In Silico and experimental determination of IL1β-receptor inhibitor peptides
Bilgisayar ortamında ve deneysel olarak IL1-β reseptör inhibitörü peptitlerin belirlenmesi
FULYA AKŞİT
Yüksek Lisans
İngilizce
2020
Kimya MühendisliğiKoç ÜniversitesiKimya ve Biyoloji Mühendisliği Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. CEM ALBAYRAK
PROF. DR. BURAK ERMAN
- Computational analysis of binding preferences of PICK1 for its PDZ partners
PICK1 proteininin PDZ partnerlerine bağlanma tercihlerinin hesaplamalı analizi
BEHİYE TUĞÇE YILDIZOĞLU
Yüksek Lisans
İngilizce
2012
Mühendislik BilimleriKoç ÜniversitesiHesaplamalı Bilimler ve Mühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ÖZLEM KESKİN
- Dynamic analysis of sumo conjugation cascade by molecular modeling and simulations
Sumo konjugasyon basamaklarının moleküler modelleme ve siımulasyon ile incelenmesi
EZGİ KARACA
Yüksek Lisans
İngilizce
2008
Kimya MühendisliğiBoğaziçi ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. TÜRKAN HALİLOĞLU
- Hiperinsülinemi etkisiyle posttranslasyonel modifikasyona uğrayan enzimlerin dinamiğinin incelenmesi ve inhibitör moleküllerin araştırılarak in vitro ortamda test edilmesi
Investigation of dynamics of enzymes which undergo hyperinsulinemia-mediated phosphorylation and discovery of inhibitor molecules that inactivates these enzymes
HANİFE PEKEL
Doktora
Türkçe
2022
Biyolojiİstanbul Medipol ÜniversitesiSinir Bilim Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
PROF. DR. MUSTAFA GÜZEL
DR. ÖĞR. ÜYESİ ÖZGE ŞENSOY
- Coiled coil domain containing protein 124'ün post-translasyonel modifikasyonlarının hücresel moleküler etkileşimler üzerine etkileri
The effects of post-translational modifications of coiled coil domain containing protein 124 on cellular molecular interactions
GAMZE ÇAKIRCA
Doktora
Türkçe
2024
GenetikGebze Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. UYGAR HALİS TAZEBAY