The regulatory effect of CcarR activator on the cephamycin C gene cluster of Streptomyces clavuligerus
CcaR aktivatörünün Streptomyces clavuligerus?a ait sefamisin C gen kümesi üzerindeki düzenleyici etkisi
- Tez No: 304964
- Danışmanlar: PROF. DR. GÜLAY ÖZCENGİZ
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Mikrobiyoloji, Genetik, Biyoteknoloji, Microbiology, Genetics, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2011
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoloji Bölümü
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Streptomyces clavuligerus, bir ß-laktam antibiotiği olan sefamisin C ve güçlü bir ß-laktamaz inhibitörü olan klavulanik asit gibi endüstriyel açıdan önemli sekonder metabolitleri üretmektedir. Sefamisin C, sefalosporin çekirdeğinin C-7. pozisyonunda bir metoksil grubunun varlığı dolayısıyla penisiline dirençli bakterilere karşı etkilidir. Klavulanik asit ß-laktam antibiyotikleri ile birlikte bakteri nedenli enfeksiyonların tedavisinde kullanılmaktadır. Sefamisin C ve klavulanik asit gen kümeleri S. clavuligerus' un genomunda ß-laktam süperkümesini oluştururlar. Sefamisin C gen kümesinde yeralan ccaR geni tarafından kodlanan CcaR (Sefamisin C-Klavulanik asit Regülatörü) ß-laktam süperkümesinin pozitif bir regülatörüdür. Sefamisin gen kümesi ile ilgili daha onceki çalışmalar sefamisin C genlerin ekspresyonlarını ve protein düzeyinde fonksiyonlarını belirlemek üzere S1 nükleaz (Paradkar ve ark., 1994), Northern (Perez-Llarena ve ark., 1997) ve Western blot (Alexander ve Jensen, 1998) gibi farklı teknikleri kullanmış olup gen kümesinin farklı kısımları üzerinde çalışmışlardır. Bu yüzden, S. clavuligerus tarafından antibiyotik üretimini anlamaya yönelik geniş kapsamlı bir çalışmaya gereksinim vardır.Bu çalımanın amacı, hücre içerisinde sefamisin C biyosentezinin yolak-özgü CcaR proteini tarafından regülasyonunun moleküler mekanizmalarını detaylı bir şekilde incelemektir. Bu amaçla, RT-PCR ve qRT-PCR çalışmalarıyla, hücrede pozitif regülatör gen ccaR' nin yokluğunda ve bu genin çoklu ifadesi durumunda tip suşa kıyasla sefamisin C biyosentetik gen kümesinin zamana bağlı ekspresyon profili analiz edilmiştir. Ayrıca, CcaR proteininin sefamisin gen kümesindeki DNA-bağlanma bölgeleri EMSA deneyleri ile incelenmiştir. Yine ccaR geninin olmadığı ya da çok kopya olarak bulunduğu rekombinant suşlarda sefamisin C ve klavulanik asit üretimi biyoassay ve HPLC analizleri ile tespit edilmiştir.Sefamisin C gen kümesindeki genlerin RT-PCR analizleriyle, üç farklı polisistronik ve iki monosistronik transkript belirlenmiştir. Sefamisin C gen kümesinin CcaR tarafından kontrolü, en çok ccaR, lat, cmcI, cefD, blp ve cefF genlerinin ekspresyon seviyelerinde gözlenmiştir. qRT-PCR ile elde edilen bu veriler, CcaR'nin lat, cefD?cmcI, cefF, blp ve ccaR promotor bölgelerine bağlandığının gösterildiği EMSA sonuçlarıyla desteklenmiştir. ccaR' nin hücrede çoklu ifadesi her iki sekonder metabolitin üretiminde önemli bir artış sağlayarak biyoteknolojik açıdan etkin bir üretici suş geliştirilmesini sağlamıştır. Bu çalışmanın sonuçları, CcaR aktivatörünün sefamisin C kümesindeki genlerin ekspresyonları üzerindeki zaman bağlı etkisini ortaya koyan ilk raporu oluşturmaktadır.
Özet (Çeviri)
Streptomyces clavuligerus produces industrially important secondary metabolites such as cephamycin C (a ß-lactam antibiotic) and clavulanic acid (a potent ß-lactamase inhibitor). Cephamycin C is active against penicillin-resistant bacteria due to presence of methoxyl group in C-7 position of cephalosporin nucleus. Clavulanic acid is prescribed in combination with ß-lactams for treatment of various bacterial infections. Cephamycin C and clavulanic acid gene clusters form ß-lactam supercluster in S. clavuligerus genome. CcaR (Cephamycin C-Clavulanic Acid Regulator), encoded by ccaR, located in cephamycin C gene cluster, is a positive regulator of ß-lactam supercluster. Previous studies on cephamycin C gene cluster have used different techniques, such as S1 nuclease (Paradkar et al., 1994), Northern blot (Perez-Llarena et al., 1997), and Western blot (Alexander and Jensen, 1998) to determine expression of cephamycin C genes at mRNA level and to identify their functions at protein level, and they have studied on different parts of the cluster. Hence, a comprehensive study is needed to understand molecular mechanisms of pathway-specific regulation of cephamycin C production by S. clavuligerus.In this study, time-dependent expression levels of cephamycin C gene cluster in a ccaR-disrupted mutant and ccaR-overexpressed recombinant strain of S. clavuligerus as compared to those in the wild strain were analysed by RT-PCR and qRT-PCR. In addition, DNA-binding sequences of CcaR on cephamycin C gene cluster were examined by EMSA. The effect of ccaR disruption and overexpression on cephamycin C and clavulanic acid yields were determined by bioassay and HPLC.Three polycistronic and two monocistronic transcripts were obtained by RT-PCR. CcaR regulation showed its effect on mostly ccaR, lat, cmcI, cefD, blp and cefF expression levels. qRT-PCR data was supported by EMSA showing CcaR binding to lat, cefD?cmcI and ccaR promoters. ccaR overexpression from multi-copy recombinant plasmid resulted in significant increase in cephamycin C and clavulanic acid yields, making the respective recombinant strain as an attractive industrial strain. qRT-PCR data presented herein constitute the first that reveal the effect of CcaR activator on the expression of cephamycin C genes in a time-dependent manner.
Benzer Tezler
- BldG ve CcaR regülatör proteinlerinin Streptomyces clavuligerus'ta tunikamisin biyosentezi üzerine etkileri
The effects of BldG and CcaR regulatory proteins in tunicamycin biosynthesis in Streptomyces clavuligerus
LOKMAN BAŞ
Yüksek Lisans
Türkçe
2016
GenetikOndokuz Mayıs ÜniversitesiTarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ASLIHAN KURT KIZILDOĞAN
- Probing the effect of IKK on FOXO3: A regulatory mechanism of apoptosis and autophagy in chemoresistance
IKK nin FOXO3 üzerindeki etkisinin araştırılması: İlaç direncinde apoptoz ve otofaji düzenleyici mekanizması
TUĞSAN TEZİL
Doktora
İngilizce
2012
GenetikSabancı ÜniversitesiBiyoloji Bilimleri ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. HÜVEYDA BAŞAĞA
- The effect of system justification and regulatory focus orientation in the endorsement of honor and honor based violence
Sistemi meşrulaştırma ve düzenleme odağı yöneliminin namus ve namus temelli şiddetin onaylanmasına etkisi
GÜLÇİN AKBAŞ USLU
Doktora
İngilizce
2016
PsikolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiPsikoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NURAY SAKALLI UĞURLU
- Regulatory effect of transcriptional factor SinR and LutR on the expression of bacABCDEywfG operon in Bacillus subtilis
Bacillus subtilis'de SinR ve LutR transkripsiyon faktörlerinin bacABCDEywfG operonu üzerine düzenleyici etkisi
HASAN DEMİRCİ
Yüksek Lisans
İngilizce
2016
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
PROF. DR. AYTEN KARATAŞ
- Regulatory effect of transcriptional factors ComK and SinR on the expression of bacABCDEywfG operon in Bacillus subtilis
Bacillus subtilis'de ComK Ve SinR Transkripsiyonel Faktörlerinin bacABCDEywfG Operonu Üzerine Etkisi
ALI MOHAMMED NASSER HAIDER
Yüksek Lisans
İngilizce
2016
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
PROF. DR. AYTEN KARATAŞ