Cloning of the Scytalidium thermophilum bifunctional catalase/phenol oxidase gene and expression in Aspergillus sojae
Scytalidium thermophilum çift aktiviteli katalaz/fenoloksidaz geninin klonlanması ve Aspergillus sojae'de heterolog ifadesi
- Tez No: 177578
- Danışmanlar: PROF. DR. UFUK BAKIR, PROF. DR. ZÜMRÜT BEGÜM ÖGEL
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Gen klonlama, Katalaz, Scytalidium thermophilum, Gene cloning, Catalase, Scytalidium thermophilum
- Yıl: 2008
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Scytalidium thermophilum, termofilik bir küf olup yemeklik mantar olan Agaricus bisporus'un üretilmesinde verimi artırıcı önemli bir role sahiptir. Laboratuvarımızda daha önce yapılan çalışmalara göre, Scytalidium thermophilum diğer fenol oksidazlarda görülmeyen bazı farklı özelliklere sahip yeni bir hücre dışı fenol oksidaz (STEP) üretmektedir. Daha sonra yapılan çalışmalar sonucunda, S. thermophilum hücre dışı fenol oksidaz enziminin aslında bir katalaz olduğu, bunun yanında da fenol oksidaz aktivitesine sahip olduğu belirlenmiştir.Bu çalışmada, daha sonra yapılacak olan yönlendirilmiş mutasyon çalışmaları için Scytalidium thermophilum çift aktiviteli katalaz/fenol oksidaz enzimini kodlayan genin klonlanması ve Aspergillus sojae' de heterolog olarak üretimi amaçlanmıştır. Scytalidium thermophilum katalaz geni ilk olarak E.coli XL1 Blue MRF' e klonlanmış, daha sonra Aspergillus sojae ATCC11906' de heterolog olarak ifade edilmiştir. Bu amaçla, sinyal peptit ve pro-peptit bölgesini dışarıda bırakacak şekilde, genin başından ve sonundan tasarlanan spesifik primerler vasıtasıyla katalaz geninin amplifikasyonu gerçekleştirilmiştir. Elde edilen parçalar E.coli XL1 Blue MRF'e klonlanmış ve klonlanan gen catpo olarak adlandırılmıştır. Dizilim analizi sonucunda, catpo geninin kodladığı amino asit dizilimindeki 10 amino asidin, daha önce Novo Nordisk tarafından klonlanmış olan Scytalidium katalaz geninin kodladığı amino asit diziliminden farklı olduğu belirlenmiştir. Daha sonra, 681 amino asitten oluşan olgun proteini kodlayan catpo geni, pAN52-4 ekspresyon vektörlerine aktarılmış ve elde edilen rekombinant plazmidin Aspergillus sojae ATCC11906 suşuna transformasyonu gerçekleştirilmiştir. Aspergillus niger glukoamilaz geninin sinyal peptit bölgesi altına takılan catpo geninin, Aspergillus nidulans gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz promotörü kontrolünde heterolog ekpresyonu tanımlanmıştır. Aspergillus sojae transformantlarında katalaz aktivitesi 13206 U/g değerine ulaşmıştır, fakat bu değer gen donörü olan Scytalidium thermophilum'un katalaz aktivitesinden daha düşüktür.
Özet (Çeviri)
Scytalidium thermophilum is a thermophilic fungus with an important role in the composting process of mushroom cultivation. An extracellular phenol oxidase of Scytalidium thermophilum (STEP) with novel features was previously studied in our laboratory. This enzyme later turned out to be a catalase having phenol oxidase activity.The aim of this study was to clone Scytalidium thermophilum bifunctional catalase/phenol oxidase encoding gene and express the gene in Aspergillus sojae for future site directed mutagenesis studies. Scytalidium thermophilum catalase gene was first cloned into E. coli XL1 Blue MRF? and then heterologously expressed in Aspergillus sojae ATCC11906. For that aim, the catalase gene was amplified using specific primers, excluding the signal and pro-peptide coding regions and amplified fragment was then cloned into E.coli XL1 Blue MRF? and sequenced. It was observed that the cloned gene, named as catpo, was 10 amino acids different from the amino acid sequence of the S.thermophilum catalase gene formerly cloned by Novo Nordisk. The catpo gene encoding a mature protein of 681 amino acids was then ligated onto expression vector pAN52-4 and the recombinant plasmid was transformed into Aspergillus sojae ATCC11906. Heterologous expression was observed under the control of the glyceraldehydes 3-phosphate dehydrogenese promoter of Aspergillus nidulans and the secretion signal of the glucoamylase gene of Aspergillus niger. Catalase activity of the transformants reached at a level of 13206 U/g at the end of the fourth day of cultivation. However, this is still lower than the catalase activity of the gene donor strain of Scytalidium thermophilum.
Benzer Tezler
- PCR cloning and heterologous expression of scytalidium thermophilum laccase gene in aspergillus sojae
Scytalidium thermophilum lakkaz geninin PCR tekniği ile klonlanması ve Aspergillus Sojae'de heterolog ekspresyonu
GÜLDEN KOÇLAR
Yüksek Lisans
İngilizce
2005
BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZÜMRÜT BEGÜM ÖĞEL
PROF. DR. UFUK BAKIR
- Cloning of the terminal oxidase from purple sulfur bacterium Allochromatium vinosum
Mor kükürt bakterisi Allochramatium vinosum'un terminal oksidazının klonlanması
TUTKU AYKANAT
Yüksek Lisans
İngilizce
2003
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. BENAN DİNÇTÜRK
- Cloning of thermostable glucose isomerase of thermus thermophilus in escherichia coli
Thermus themophilus'ün ısıl kararlı glikoz izomerazının escherichia colı'ye klonlanması
BERNA SARIYAR
- Sığır vebası virüsü matriks geninin klonlanması ve ökaryotik hücrelerde açıklanması
Cloning of matrix gene of rinderpest virus and expression in eucaryotic cells
AHMET KÜRŞAT AZKUR
Doktora
Türkçe
2002
Veteriner HekimliğiFırat ÜniversitesiViroloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. YUSUF BOLAT
PROF. DR. MEHMET ZİYA DOYMAZ
- Cloning of TaqI endonuclease gene into E.coli and isolation of the enzyme by using pMAL-p2 vector system
pMAL-p2 vektör sistemi kullanılarak TaqI restriksiyon enzim geninin E.coli'ye klonlanması ve enzimin izolasyonu
PEMBE HANDE ÖZDİNLER