Geri Dön

Transforme edici büyüme faktörü alfa(TGF-alfa)'nın değişik formülasyonlarının geliştirilmesi, in vitro ve in vivo değerlendirilmesi

Development of different formulations of transforming growth factor alpha (TGF-alfa), in vitro and in vivo evaluation

  1. Tez No: 123594
  2. Yazar: GÜLAY YETKİN
  3. Danışmanlar: PROF.DR. NEVİN ÇELEBİ
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Eczacılık ve Farmakoloji, Pharmacy and Pharmacology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2002
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Gazi Üniversitesi
  10. Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Farmasötik Teknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

187 G. ÖZET Yara iyileşmesi hücrelerin bölünmesi ve göçü, yeni damar oluşumu, hücreler arası matriks proteinlerin sentezi ve bağ dokusunun yeniden oluşumunu içeren kompleks bir biyolojik süreçtir. Büyüme faktörleri, doku iyileşmesi fazlarının başlatılmasında ve sürekliliğininde anahtar rol oynar. Transforme edici büyüme faktörü alfa (TGF-a), gastrointestinal sistemin mukozal hücrelerinin farklılaşmasında ve çoğalmasında önemli rol oynar. Mide mukozasında TGF-a'nın diğer etkileri, mide asit sekresyonunun azaltılması, çeşitli ülser yapıcı faktörlere karşı koruma ve mide mukus üretiminin uyarımıdır. Son zamanlarda, gastrointestinal sistem yaralarında, bu özellikleri nedeniyle dışarıdan TGF-a'nın kullanımı önem kazanmıştır. Bu çalışmanın amaçları. Gastrointestinal bölgede TGF-a'nın stabilitesini artıracak oral mikroemülsiyon ve lipozom formülasyonları geliştirmek,. TGF-a içeren bu formülasyonların oral uygulanmasının, gastrointestinal sistemin fizyolojik koşullarına ve mukozal (mide ve duodenum) TGF-a düzeylerine etkisini araştırmak,. Proteaz enzim inhibitörü (aprotinin) içeren mikroemülsiyonun TGF-a'yı gastrointestinal bölgedeki enzimatik aktiviteden koruyup korumadığını incelemek,. CLSM kullanarak, eksojen TGF-a'nın mide, duodenum, jejenum ve ileum dokularındaki endojen EGF reseptörlerine bağlanıp, bağlanmadığını gözlemek,. Mikroemülsiyon formülasyonu içinde oral uygulanan TGF-a'nın, sıçanlarda ASA ile oluşturulan mide ülseri üzerindeki iyileştirici etkinliğini saptamaktır. Mikroemülsiyon formülasyonları, yağ fazı olarak Labrafıl M 1944CS, surfaktan olarak Arlacel 186:Brij 35 (5:1), kosurfaktan ve su fazı olarak, absolu alkol ve bidistile su kullanılarak hazırlanmıştır. TGF-a (10 jıg/kg) sulu188 faza ilave edildi. Aprotinin (3000 KIU/mL) enzim inhibitörü olarak mikroemülsiyon formülasyonuna ilave edildi. Damlacık büyüklüğü, viskozite, yoğunluk, bulanıklık, refraktif indeks, faz ayrışması ve pH ölçümleri mikroemülsiyonu karakterize etmede kullanıldı. Mikroemülsiyonun tüm fizyolojik özellikleri, sistemde TGF-ct ve aprotinin yokken ölçüldü. Mikroemülsiyonun fiziksel stabilitesi farklı saklama koşulları altında (4°C, 25°C, 40°C) 12 ay süre ile saptandı. TGF-a'nın mikroemülsiyondaki stabilitesi 4°C'de üç ay, 25°C'de iki ay incelendi. TGF-a'nın miktarları radioimmunoassay (RIA) ile ölçüldü. TGF-a'nın mikroemülsiyondan in vitro salımı, 37.0±0.1°C'de pH 1.2 mide ortamında, Franz difüzyon hücresi kullanılarak incelendi. Lipozom formülasyonlarının hazırlanmasında dipalmitoil fosfotidil kolin ve kolesterol kullanıldı. Tabaka sayısı, partikül büyüklüğü ve büyüklük dağılım ölçümleri lipozomu karakterize etmede kullanıldı. TGF-a'nın tutunma oranı Lowry ve RIA yöntemleri ile ölçüldü. Çalışmada 200±20 g ağırlığındaki erkek Wistar sıçanlar kullanıldı. Her grupta 8-12 sıçan olmak üzere altı ana gruba (C, ME, TME, TAME, LP and TLP) ayrıldı. TGF-a'nın mide dokusunda en uzun kaldığı süreyi saptamak için immünohistokimyasal çalışmalar yapıldı. TGF-a veya TGF-a'ya ilave olarak aprotinin içeren mikroemülsiyonlar sıçanlara kanülle intragastrik olarak 10 ng/kg dozda uygulandı. Bazal mide asit sekresyonu (ıımol H+/30 min), birinci ve ikinci bazal pH, mide mukus sekresyonu (^g/ g doku), mide sıvısının total protein içeriği (mg protein /ml_) gibi fizyolojik parametreler ölçüldü. Mide ve duodenum mukozasındaki TGF-a düzeyleri de, büyüme faktörü için spesifik RIA kullanılarak ölçüldü. CLSM çalışmaları farklı segmentlerde TGF-a'nın reseptörlere bağlandığını saptanmak için yapıldı. Akut gastrik lezyonlar 150 mg/kg dozda ASA'nın 0.2 N HCI çözeltisi içinde intragastik (i.g.) olarak uygulanması ile oluşturuldu. TGF-a (10 jag/kg.gün"1) çözelti veya mikroemülsiyon formülasyonları içinde iki gün189 süreyle uygulandı. Bazal mide asit sekresyonu (jlütioI H+/30 min), birinci ve ikinci bazal pH, mide sıvısının total protein içeriği (mg protein /ml_), mide mukus sekresyonu (p,g/ g doku) ve ülser alanı (mm2) ölçüldü. Bütün deney gruplarında mide mukozasındaki değişimler histolojik olarak incelendi. Sonuçlar, mikroemülsiyon formülasyonunun fiziksel özelliklerinin farklı saklama sıcaklıklarında, 12 ay süreyle değişmediğini gösterdi (p>0.05). Sonuçlar, TGF-a'nın birinci derece kinetikle parçalandığını gösterdi. Aktivasyon enerjisi (Ea), 9.89 kcal/mol olarak hesaplandı. Mikroemülsiyondaki TGF-a'nın raf ömrü 4°C'de 23 gün olarak bulundu, in vitro salım çalışmalarına göre, mikroemülsiyondan TGF-a'nın salımı 6 saattte %59.7 olarak bulundu. Lipozomlar, partikül büyüklüğü ve tutunma oranı ile karakterize edildi. Lipozomların çok veziküllü veziküllerden (MW) meydana geldiği ve lipozomların partikül büyüklüğünün zamanla değiştiği görüldü. TGF-a'nın tutunma oranı RIA yöntemi ile %51.39±1.65 hesaplandı. Immunohistokimyasal çalışmalar, mide dokusunda TGF-a'nın en uzun kalış süresinin 90 dk. olduğunu gösterdi. TME ve TLP (TGF-a taşıyan mikroemülsiyon ve lipozom formülasyonları) uygulanan grupların bazal mide asit düzeyleri, kontrol mikroemülsiyon (ME) ve kontrol lipozom (LP) gruplannkinden daha düşük bulundu (p<0.05). Aprotinin içeren TGF-a mikroemülsiyonunun intragastrik uygulanmasından sonra mide asit sekresyonu TME grubuna göre daha belirgin olarak azalmıştır (p<0.01). Sonuçlar, bazal asit sekresyonunda en fazla azalmanın, aprotinin içeren TGF-a mikroemülsiyonu uygulandıktan sonra oluştuğunu gösterdi. Benzer sonuçlar birinci bazal pH düzeylerinde de görüldü. TME ve TLP gruplarının birinci bazal pH düzeyleri ME ve LP gruplarınkinden yüksek bulundu (p<0.05). Buna karşın sonuçlar en yüksek artışın TAME grubunda olduğunu gösterdi (p<0.01).190 ikinci bazal pH düzeyleri, TGF-a içeren mikroemülsiyonlar (TME, TAME grupları) ve TGF-a içeren lipozom (TLP grubu) ile tedavi sonrasında kendi kontrol grupları (ME ve LP) ile karşılaştırıldığında, anlamlı olarak yükselmedi (p>0.05). Benzer sonuçlar mide sıvısının total protein içeriğinde de görüldü (p>0.05). TME ve TLP gruplarının mide mukus sekresyonları, ME ve LP grupları ile karşılaştırıldığında belirgin olarak arttı (p<0.05). Mide mukus sekresyonu artışı TAME grubunda daha belirgindi (p<0.01). TGF-a ve aprotinin içeren mikroemülsiyonun (TAME grup) i.g. uygulanmasından sonra midedeki TGF-a düzeyleri, mikroemülsiyon (ME) ve kontrol grupları ile karşılaştırıldığında anlamlı olarak arttı (p<0.001). Diğer taraftan, TME ve TLP grupların mide doku TGF-a düzeyleri ME ve LP grupları ile karşılaştırıldığında belirgin olarak artmadı (p>0.05). TAME grubunun duodenumdaki TGF-a düzeyleri ME grupla karşılaştırıldığında belirgin olarak artmıştır (p<0.05). CLSM görüntülerine göre, kontrol grubun TGF-a düzeyleri normal fizyolojik konsantrasyonlardadır. Ancak TGF-a düzeyleri, TGF-a'nın intragastrik uygulandığı gruplarda, normal konsantrasyonların çok üzerinde bulunmuştur. Ü-TAME (TGF-a ve aprotinin içeren mikroemülsiyon), Ü-TME (TGF-a içeren mikroemülsiyon), Ü-AME (aprotinin içeren mikroemülsiyon) ve Ü-TSF (TGF-a içeren çözelti) ile tedavi edilen grupların bazal mide asit düzeyleri, kendi kontrol (Ü-ME ve Ü-SF) grupları ile karşılaştırıldığında, belirgin olarak azalmıştır (p<0.001, p<0.001, p<0.01 ve p<0.05). Buna karşın, sadece Ü- TAME grubunun bazal mide asit düzeyi tedavi edilmemiş gruba (Ü-KHB) göre azalmıştır (pO.001). TGF-a içeren çözelti ve mikroemülsiyonlarla tedavi edilen gruplarda mide sıvısında bazal pH'nın ilk ölçümü, kendi kontrol gruplarından anlamlı olarak artmamıştır (p>0.05). Benzer sonuçlar ikinci bazal pH düzeylerinde de191 görülmüştür. Ü-TME ve Ü-TAME gruplarının ikinci pH ölçümleri, tedavisiz gruba (Ü-KHB) göre belirgin artmıştır (p<0.05 ve p<0.01). Ü-TME ve Ü-TAME gruplarının mide sıvısının total protein içeriği ME grubunkinden belirgin olarak azalmıştır (p<0.001). Buna ilave olarak Ü-TAME grubunun mide sıvısının total protein içeriği Ü-KHB gruba göre belirgin azalmıştır (p<0.05). Ortalama ülser alanları, TGF-a ile tedavi edilen tüm gruplarda, kendi kontrol gruplarına göre belirgin olarak azalmıştır. Tedavili grupların (Ü-AME, Ü-TSF, Ü-TME ve Ü-TAME) ülser alanları 45.3±6.1 mm2, 34.7±3.4 mm2, 21.7±6.8 mm2 ve 12.2±2.7 mm2 olarak hesaplanmıştır. Sonuçlar, ülser alanında en büyük azalışın Ü-TAME grubunda olduğunu göstermiştir. (p<0.001). TGF-a ile tedavi edilen grupların mide mukus düzeyleri kendi kontrol gruplarına göre belirgin artmıştır. Mide mukus düzeylerinde en fazla artış Ü- TME ve Ü-TAME gruplarında görülmüştür. (p<0.001). Histolojik çalışmalara göre, mikroemülsiyon formülasyonu içinde oral yoldan uygulanan TGF-a mide ülser yaralarının iyileşmesini artırmıştır. Sonuçlar, TGF-a'nın mikroemülsiyon ve lipozom ilaç şekilleri içinde oral yoldan uygulanabileceğini göstermektedir. TGF-a'nın oral yoldan uygulanması için mikroemülsiyon formülasyonunun daha uygun bir taşıyıcı sistem olduğu kanısına varılmıştır. Buna ilave olarak mikroemülsiyon formülasyonuna ilave edilen aprotininin, TGF-a'nın etkisini artırdığı gözlenmiştir.

Özet (Çeviri)

192 H. SUMMARY Wound healing is a complex biologic process that involves migration and division of cells, neovascularization, synthesis of extracellular matrix proteins and remodeling of scar. Growth factors play key roles in initiating and sustaining the phases of tissue repair. Transforming growth factor alpha (TGF-oc), plays important roles in proliferation and differentiation of mucosal cells of the gastrointestinal tract. Other effects of TGF-a in gastric mucosa include inhibition of gastric acid secretion, protection against various ulcerogenic factors and stimulation of gastric mucous production. Recently, the use of exogenous TGF- a due to these properties plays important roles in gastrointestinal tract wounds. The objective of this study were;. to develop oral microemulsion and liposome formulations that will increase the stability of TGF-a in gastrointestinal tract,. to investigate the effects of oral administration of these formulations containing TGF-a on physiological conditions of gastrointestinal tract and mucosal (stomach and duodenum) TGF- a levels,. to examine the microemulsion containing protease enzyme inhibitor (aprotinin) to observe whether it prevents TGF-a from enzymatic activity in the gastrointestinal tract or not.. to observe whether exogen TGF-a binds to endogen EGF receptors in the stomach, duodenum, jejenum and ileum tissues or not, using confocal laser scanning microscopy (CLSM).. to determine ulcer healing efficiency of TGF-a, which was oral administration in microemulsion formulation, on gastric ulcer induced by ASA in rats. The microemulsion formulation were prepared using Labrafll M 1944CS, Arlacel 186:Brij 35 (5:1), absolute alcohol and bidistilled water as the oil phase,193 surfactant, co-surfactant and aqueous phase, respectively. TGF-a (10 ng/kg) was added into water phase. Aprotinin (3000 KlU/mL) was incorporated as enzyme inhibitors in the microemulsion formulation. The droplets size, viscosity, density, turbidity, refractive index, phase separation, and pH measurements were performed to characterize microemulsion. All physical characteristics of the microemulsion were measured when TGF-a and aprotinin were not present in the system. The physical stability of the microemulsion was determined under different storage conditions (4°C, 25°C, 40°C) during 12 months. The stability of TGF-a in microemulsion was also investigated at 4°C or 25°C for three and two months, respectively. Amounts of TGF-a were measured by radioimmunoassay (RIA). The in vitro release of TGF-a from microemulsion formulation was carried out using Franz diffusion cell in pH 1.2 gastric medium at 37.0±0.1°C. The liposome formulations were prepared using dipalmitoyl phosphotidyl choline and cholesterol. The bilayer number and particle size and size distribution measurements were performed to characterize liposome. Entrapment ratio of TGF-a was measured by Lowry and RIA methods. Male Wistar rats, weighing 200±20 g were used throughout the study. They were divided into six major groups (C, ME, TME, TAME, LP and TLP), including 8-12 rats. Immunohistochemical studies were performed in stomach to determine the longest duration time of TGF-a in the stomach tissue. The microemulsions containing TGFa or TGFa plus aprotinin, were administered intragastrically at a dose of 10 ng/kg with a cannula to rats. The physiological parameters such as basal gastric acid secretion (jimol H730 min), first and second basal pHs, gastric mucus secretion (pg/ g tissue), protein content in stomach fluid (mg protein /ml_) were determined. The stomach and duodenum mucosal TGF-a levels were also measured using RIA which is194 specific for the growth factor. CLSM studies were done to observe binding of TGF-a to receptors at different segments. Acute gastric lesions were produced by intragastric (i.g.) administration of ASA at 150 mg/kg in 0.2 N HCI solution. TGF-a (10 ng/kg per day) in solution or microemulsion formulations were administered intragastically for two days. Basal gastric acid secretion (fj.mol H+/30 min), first and second basal pHs, protein content in stomach fluid (mg protein /mL), gastric mucus secretion (\xg/ g tissue) and ulcer area (mm2) were measured. The changes in the stomach mucosa were histologically examined in all experimental animal groups. The results indicated that the physical characteristics of the developed microemulsion formulation, did not change under different storage temparatures during 12 months (p>0.05). The results show that TGF-a degrades via first order kinetics. The activation enegy (Ea) was calculated as 9.89 kcal/mole. The shelf life (tgo) of TGF-a in microemulsion was found to be 23 days at 4°C. According to the in vitro release study the release of TGF-a from microemulsion was found as 59.7% within 6 hours. Liposomes were characterized by particle size and entrapment ratio. It was observed that liposomes consisted of multi vesicular vesicles (MW), and the particle size of liposomes changed with time. Entrapment ratio of TGF-a was calculated as %51.39±1.65 using RIA methods. Immunohistochemical studies indicated that the longest duration time of TGF-a was 90 min in stomach tissue. The basal gastric acid levels of TME and TLP (microemulsion and liposomes containing TGF-a) treated groups were found to be lower than those of the control microemulsion (ME) and control liposomes (LP) treated groups, respectively (p<0.05). The gastric acid secretion was significantly reduced after the intragastric administration of TGF-a microemulsion containing aprotinin (TAME), rather than microemulsion (TME) treatment (p<0.01). The results195 indicated that the highest reduction in the basal acid secretion was observed after the administration of microemulsion of TGF-a containing aprotinin. Similar results were also observed in first basal pH levels. The first basal pH of TME and TLP treated groups were found to be higher than those of the ME and LP treated groups, respectively (p<0.05). However, the results indicated that the highest increase in the first basal pH was observed in TAME group (p<0.01). The second basal pH levels were not significantly increased after treated with microemulsions containing TGF-a (TME, TAME groups) and liposomes containing TGF-a (TLP group) compared to their control groups (ME and LP) (p>0.05). Similar results were also obtained for total protein contents of stomach fluids (p>0.05). The gastric mucus secretions in TME and TLP treatment groups increased significantly compared to ME and LP groups (p<0.05). The increase of gastric mucus secretion was more significant in TAME group (p<0.01). TGF-a levels in stomach were significantly increased after the i.g. administration of microemulsion containing TGF-a and aprotinin (TAME group) compared to microemulsion (ME) and control (C) groups (p<0.001). On the other hand, there was no significant increase in stomach tissue TGF-a levels of TME and TLP groups compared to ME and LP groups, respectively (p>0.05). TGF-a levels in duodenum of TAME treated group was increased significantly compared to ME group (p<0.001). Based on the CLSM imaging, TGF-a levels in the control group were about normal physiological concentration. However, it has been observed that, TGF-a levels were found to be significantly above the normal concentration in groups in which TGF-a was administered intragastrically. The basal gastric acid levels of Ü-TAME (microemulsion containing TGF- a and aprotinin), Ü-TME (microemulsion containing TGF-a), Ü-AME196 (microemulsion containing aprotinin) and Ü-TSF (solution containing TGF-a) treated groups were reduced significantly compared to their control (Ü-ME and Ü-SF) groups (p<0.001, p<0.001, p<0.01 and p<0.05), respectively. Contrary, only Ü-TAME group's basal gastric acid level was decreased compared to untreated (Ü-KHB) group (p<0.001). The first measurement of pH in stomach fluid of microemulsions and solution containing TGF-a treated groups were not significant increased compared to their control groups (p>0.05). Similar results were also obtained for the second basal pH levels. In second pH measurements of Ü-TME and Ü- TAME groups were increased significantly compared to untreated (Ü-KHB) group (p<0.05 and p<0.01). The total protein content of stomach fluid of Ü-TME and Ü-TAME groups were significantly decreased compared to ME group (p<0.001). In addition total protein content of stomach fluid of Ü-TAME group was remarkably reduced compared to Ü-KHB group (p<0.05). The mean ulcer areas in all treated groups with TGF-a were significantly reduced compared to their control (p<0.001). Ulcer areas in treated groups (Ü- AME, Ü-TSF, Ü-TME and Ü-TAME) were calculated as 45.3±6.1 mm2, 34.7+3.4 mm2, 21.7±6.8 mm2 and 12.2±2.7 mm2, respectively. The results indicated that the highest decrease in ulcer area was observed in Ü-TAME group (p<0.001). The gastric mucus levels of treated TGF-a groups were remarkably increased compared to their control groups. The maximum increase in gastric mucus level were observed in Ü-TME and Ü-TAME groups (p<0.001). According to histological studies, oral administration of TGF-a in microemulsion formulation enhanced the healing of gastric ulcer. In conclusion, oral administration of TGFa in microemulsion and liposome dosage forms may be appropriate. Furthermore, microemulsion formulation was found to be more suitable carrier system for oral administration of TGFa. In197 addition incorporation of aprotinin to microemulsion formulation has a positive effect on TGFa's efficiency.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    103256

    Epidermal büyüme faktörü alfa reseptörleri ve transforme edici büyüme faktörü alfanın insan ovaryumu gelişen folliküllerindeki dağılımının immünohistokimyasal olarak belirlenmesi

    Determination of the distribution of epidermal growth factor receptors and transforming growth factor alpha in the follicles of growing human ovary by immunohistochemical methods

    BEHİCE BAĞDAGÜL AYAŞ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2001

    MorfolojiGazi Üniversitesi

    Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF.DR. DENİZ ERDOĞAN

  2. Tez No

    192344

    Akciğer kanserinde büyüme faktörleri

    Growth factors in lung cancer

    NUSRET ALP ONATASLAN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2006

    BiyokimyaEskişehir Osmangazi Üniversitesi

    Biyokimya Ana Bilim Dalı

    PROF.DR. ÖZKAN ALATAŞ

  3. Tez No

    225596

    Involvement of serotonin in the development of cardiac remodeling

    Kardiyak yeniden düzenlenimde serotoninin rolü

    SAMİYE YABANOĞLU

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2008

    BiyokimyaHacettepe Üniversitesi

    Biyokimya Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. GÜLBERK UÇAR

  4. Tez No

    118117

    Ekstraselüler matriks proteinlerinin ve anjiojenik büyüme faktörlerinin intrakranial kordomalardaki ekspresyonu ve prognostik değeri

    Başlık çevirisi yok

    M. LEVENT DENİZ

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2002

    NöroşirürjiMarmara Üniversitesi

    Nöroşirürji Ana Bilim Dalı

  5. Tez No

    59256

    Gebelik öncesi ve gebelik dönemi sıçan ovaryumunda transforme edici gelişim faktörü alfa (TGFa) laminin, desmin ve fibronektinin dağılımı

    Distribution of transforming growth factor-alpha (TGFa), laminin, desmin and fibronectin in pre-and thru-gestational periods of rat ovary

    GÖKHAN AKKOYUNLU

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    1997

    MorfolojiAkdeniz Üniversitesi

    Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. RAMAZAN DEMİR

Geri Dön