İn vitro fertilizasyon yöntemi ile elde edilen koyun embriyolarının dondurulması
Cryopreservation of sheep embryos derived in vitro
- Tez No: 118773
- Danışmanlar: DOÇ.DR. SEMA BİRLER
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Veteriner Hekimliği, Veterinary Medicine
- Anahtar Kelimeler: Koyun, ko-kültür, vitrifikasyon, etilen glikol, gliserol, blastosist, Sheep, co-culture, vitrification, ethylene glycol, glycerol, blastocyst
- Yıl: 2002
- Dil: Türkçe
- Üniversite: İstanbul Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Dölerme ve Suni Tohumlama Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
8. Özet Çalışmada, ilk aşama olarak mezbaha materyali koyun ovaryumlarından kazanılan oositlerin in vitro oyunlaştırılması ve in vitro fertilizasyonu ile elde edilen embriyoların blastosist dönemine kadar in vitro kültüründe ko-kültürün; ikinci aşama olarak ise bu in vitro üretilen embriyoların vitrifikasyon yöntemi ile dondurulmasında iki farklı dehidrasyon sisteminin etkilerini ortaya koymak amaç edinilmiştir. Araştırmanın ilk bölümünde mezbahada kesilen koyunların ovaryumlarından elde edilen oositler (n= 3705) olgunlaştırma medyumu içerisinde (Hepes tamponlu, Na piruvat, LH, FSH ve FCS ilaveli TCM-199), 38.5°C ısı ve atmosfer havasında %5 CC^'in sağlandığı ortamda 24 saat inkübe edildi. Olgunlaştırmayı takiben %2 SES ilaveli, bikarbonat tamponlu SOF içerisine alınan oositler (n=3159) üzerine, percoll-gradient yöntemi ile hazırlanan taze koç sperması (0,8-1x1 06 spermatozoon/ml) ilave edilerek aynı şartlarda 20 saat inkübe edildi. Koyun embriyolarının in vitro üretilmesinde ko-kültürün etkilerini araştırmak amacıyla fertilizasyonu takiben oositler iki gruba ayrıldı ve SOF medyumu içerisinde ko-kültüre (n=1485) ve kültüre (n=1535) (38.5°C ısı ve %5 CO2, %5 O2, %90 N2'in sağlandığı ortamda) edildi. Ko-kültür grubunda kültür ortamına koyun ovidukt epitel hücreleri ilave edildi. Ko-kültür ve kültür gruplarına göre sırasıyla %74,20 (1102/1485) ve %75,17 (1154/1535) yarıklanma, %17,05 (188/1102) ve %14,38 (166/1154) blastosist oranları elde edildi. Gruplar arasındaki farklar istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı (p>0.05). Çalışmanın vitrifikasyon bölümünde, in vitro ko-kültür ve kültür ile elde edilen blastosistler tekrar ikişer alt gruba ayrıldı ve 1. ekilibrasyon solüsyonu olarak 1. alt gruplarda (n=157; ko-kültür=87, kültür=70) %20 etilen glikol, 2. alt gruplarda ise (n=159; ko-kültür=87, kültür=72) %10 gliserol içerisinde 5 dakika ve daha sonra 2. ekilibrasyon solüsyonu (alt grupların tümünde %20 EG + %10G) içerisinde 5 dakika bekletildikten sonra vitrifikasyon solüsyonuna (grupların tümünde %25 EG + %25 G) alındı ve en fazla 30 saniye tutulduktan sonra payetlere yerleştirilerek sıvı nitrojene daldırıldı. Vitrifikasyon ve ekilibrasyon medyumlarında temel solüsyon olarak, %15 FCS, 0,3 mM Na piruvat ve 5,5 mM glikoz içeren PBS solüsyonu kullanıldı ve tüm işlemler oda ısısında gerçekleştirildi. Dondurulan embriyolar 2-10 ay süre ile sıvı azotta saklandıktan sonra çözündürülüp in vitro kültüre edilerek, kullanılan prosedürlerin embriyo yaşama kabiliyeti üzerindeki etkisi incelendi. Eritme işlemi, payetler 20°C'lik su banyosunda 15-20 saniye tutulduktan sonra payetin içeriği boş bir petriye boşaltılıp 5 dk. beklenerek yapıldı ve embriyolar 0,25 M sukrozda 5 dk. daha bekletildikten sonra iki kez HSOF medyumu ile yıkandı ve SOF medyumu içerinde kültüre alındı. Dondurma-eritme sonrası 24 saatlik kültürü takiben, ko- kültür grubunda (1. ve 2. dondurma gruplarına göre) sırasıyla %38,35 ve %39,28 (p>0,05); kültür grubunda (1. ve 2. dondurma gruplarına göre) ise sırasıyla %62,12 ve %30,15 oranında (p<0,001) canlılık saptandı ve gruplar arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı bulundu. Birinci dondurma grubunda elde edilen canlılık oranları (ko-kültür: %38,35; kültür: %62,12) arasındaki fark da istatistiksel olarak anlamlı oldu (p<0,005). Sonuç olarak, in vitro üretilen koyun embriyolarının vitrifikasyon yöntemiyle dondurulabileceği, embriyo üretimi amacıyla ko-kültür kullanımının gerekli olmadığı ve 1. ekilibrasyon solüsyonunda kriyoprotektan olarak etilen glikol kullanımının dondurma-eritme sonrası embriyo canlılığı üzerinde olumlu etki gösterdiği kanısına varıldı.
Özet (Çeviri)
9. Summary Cryopreservation of Sheep Embryos Derived In vitro In the study, the effects of co-culture on development to blastocyst stage of the embryos derived from in vitro maturation and fertilization of sheep oocytes collected from the ovaries of slaughtered ewes, and the effects of two different dehydration systems on cryopreservation of in vitro derived embryos frozen by vitrification method. In the first section of the study, oocytes (n=3705) recovered from the abattoir ovaries were incubated in the maturation medium (Hepes buffered, Na pyruvate, LH, FSH and FCS supplemented TCM-199) under an atmosphere with 5% C02 at 38.5°C for 24 hours. After maturation, oocytes (n=3159) which were taken into 2% SES added, bicarbonate buffered SOF medium were co- incubated with fresh ram semen separated by the percoll-gradient procedure (0.8-1x106 spermatozoon/ml) under same conditions as maturation for 20 hours. In order to investigate the effect of co-culture on in vitro production of sheep oocytes, the oocytes were divided into two groups and co-cultured (n=1485) and cultured (n=1535) in SOF medium (at 38°C temperature in 5% CO2, 5% O2 and 90% N2). In co-culture group, sheep oviduct epithelial cells were added into the culture. According to co-culture and culture groups, 74.20% (1102/1485) and 75.17% (1154/1535) cleavage rates, and 17.05% (188/1102) and 14.38% (166/1154) blastocyst rates were scored, respectively. The differences among the groups were not significant statistically (p>0.05). At the vitrification stage of the study, blastocysts produced by in vitro co- culture and culture were again divided into two subgroups and placed for 5 minutes in 20% ethylene glycol in the first subgroups (n=157, co-culture=87, culture=70) and in 10% glycerol in the second subgroups (n=157, co-culture=87, culture=72) as the first equilibration solution. In all the subgroups, blastocysts were then kept for 5 minutes in 20% EG + 10% G as the second equilibration solution and after 30 sec in vitrification solution (25% EG + 25% G), they were placed into plastic straws and immersed into liquid nitrogen. PBS solution containing 15% FCS, 0.3 mM Na pyruvate and 5.5 mM glucose was used as the basic solution in the vitrification and equilibration media and all procedures were done at room temperature. Frozen embryos were kept in liquid nitrogen for 2-10 months, then thawed and in vitro cultured to observe the effects of the vitrification procedures on the embryos survival. For thawing, the straws were immersed into a water bath at 20°C for 15-20 seconds, and then the content of the straw was emptied into a petri dish. After 5 minutes, the embryos were transferred to 0.25 M sucrose for another 5 minutes and washed twice with HSOF medium. Frozen-thawed embryos were cultured in SOF medium for 24 hours and in the co-culture group (according to 1. and 2. freezing subgroups) 38.35% and 39.28% (p>0.05); and in the culture group (according to 1. and 2. freezing subgroups) 62.12% and 30.15% viability rates (pO.001) were observed, respectively and the difference among the groups was statistically significant. In the first vitrification group, the difference between the viability rates (co-culture: 38.35%; culture: 62.12%) was also significant statistically (p<0.005). At the end of the study, it is concluded that in vitro produced sheep embryos can be frozen by vitrification method, co-culture is not necessary to produce embryos and ethylene glycol in the first equilibration solution has a beneficial effect on embryo survival after cryopreservation.
Benzer Tezler
- İn vitro fertilizasyon yöntemi ile elde edilen fare embriyolarının gelişimine farklı potasyum konsantrasyonlarının etkileri
Effects of various potassium levels on the development of in vitro fertilized mouse embryos
ÖZEN BANU ÖZDAŞ
Doktora
Türkçe
2001
Veteriner Hekimliğiİstanbul ÜniversitesiDölerme ve Suni Tohumlama Ana Bilim Dalı
DOÇ.DR. SERHAT PABUÇÇUOĞLU
- Granuloza hücrelerinde oluşan apoptozisin konvansiyonel İVF-ET sonuçlarına etkisi
Granulosa cell apoptosis and its efects on the outcome of IVF-ET procedure
GÜLTEN DEMİRSOY
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2000
Kadın Hastalıkları ve Doğumİstanbul ÜniversitesiKadın Hastalıkları ve Doğum Ana Bilim Dalı
PROF. DR. M. FERİDUN AKSU
DOÇ. DR. İSMAİL ÇEPNİ
- Fare embriyolarına mikroenjeksiyon yöntemi ile HBV DNA aktarılarak HBV replikasyonu ve gen ekspresyonunun gerçekleştiği transgenik fare modelleri oluşturulması
Transgenic mice models in which HBV replication and gene expression obtained by micro enjection method
ŞEVKİYE MÜGE CANER
Doktora
Türkçe
2001
Tıbbi BiyolojiMarmara ÜniversitesiTıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. BEYAZIT ÇIRAKOĞLU
- Yardımcı üreme tekniklerine başvuran çiftlerin danışmanlık gereksinimlerinin belirlenmesi ve hemşirenin danışmanlık hizmetinin etkinliğinin incelenmesi
Determination of counselling need of couples who participated to the assisted reproductive techniques and the evaluation of the effectiveness of the nurse's counselling services
FÜSUN TERZİOĞLU KOÇAK