Vaccinomics to design a chimeric vaccine candidate against four bordetella species
Dört bordetella türüne karşı bir kimerik aşı adayının tasarımı için vaksinomik yaklaşım
- Tez No: 995597
- Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ ÇİĞDEM YILMAZ ÇOLAK
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2026
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Bordetella cinsi bakteriler, hem insanlarda hem de hayvanlarda solunum yolu enfeksiyonlarına yol açan Gram-negatif, aerobik ve koksobasil morfolojide mikroorganizmalardan oluşan önemli bir bakteri grubudur. Bu bakteriler, özellikle solunum epiteline tutunarak siliyer hareketi bozmakta, mukosiliyer temizleme mekanizmasını engellemekte ve konak organizmada uzun süreli kolonizasyona olanak sağlayarak kronik veya tekrarlayan enfeksiyonlara neden olabilmektedir. Bu durum, enfeksiyonların kontrolünü zorlaştırmakta ve özellikle yoğun hayvancılık yapılan ortamlarda ciddi ekonomik kayıplara yol açmaktadır. Bordetella türleri, farklı konak türlerinde benzer solunum yolu patolojilerine yol açabilmeleri nedeniyle hem veterinerlik hem de insan sağlığı açısından önem taşımaktadır. Solunum yolu epitelinin hasar görmesi sonucunda gelişen inflamasyon, sekonder bakteriyel enfeksiyonların ortaya çıkmasını kolaylaştırmakta ve hastalığın şiddetini artırmaktadır. Bu süreç, özellikle genç hayvan popülasyonlarında büyüme geriliği, artmış mortalite oranları ve üretim kayıpları ile sonuçlanmaktadır. İnsanlarda ise özellikle bağışıklık sistemi baskılanmış bireylerde enfeksiyonlar daha ağır seyredebilmekte ve invaziv enfeksiyon tabloları gelişebilmektedir. Bu nedenle Bordetella enfeksiyonlarının kontrolü, yalnızca bireysel sağlık açısından değil, aynı zamanda ekonomik ve epidemiyolojik açıdan da büyük önem taşımaktadır. İnsan sağlığı açısından en iyi bilinen tür olan Bordetella pertussis, boğmaca hastalığının etkeni olup uzun yıllardır yoğun biçimde araştırılmaktadır. Bununla birlikte, pertussis dışı Bordetella türleri olan Bordetella bronchiseptica, Bordetella avium, Bordetella hinzii ve Bordetella holmesii son yıllarda klinik ve epidemiyolojik açıdan giderek daha fazla önem kazanmaktadır. B. bronchiseptica, köpeklerde kennel cough olarak bilinen enfeksiyonun önemli etkenlerinden biri olup domuzlarda atrofik rinit gibi ciddi hastalıklara neden olmaktadır. B. avium özellikle hindi yetiştiriciliğinde yaygın görülen solunum yolu enfeksiyonlarının başlıca nedenlerinden biridir ve kümes hayvancılığı açısından önemli ekonomik kayıplara yol açmaktadır. B. hinzii ve B. holmesii ise başlangıçta daha az patojen olarak değerlendirilmiş olsalar da, bağışıklık sistemi baskılanmış bireylerde ciddi enfeksiyonlara neden olabildikleri gösterilmiştir. Bazı vakalarda bu türlerin zoonotik geçiş potansiyeli göstermesi, hayvan ve insan sağlığı arasındaki ilişkinin önemini daha da artırmaktadır. Bu türlerin ortak özelliklerinden biri, konak organizmada kolonizasyonu sağlayan ve bağışıklık sisteminden kaçınmaya yardımcı olan benzer virülans mekanizmalarını paylaşmalarıdır. Hücre yüzeyi proteinleri, adezinler ve çeşitli dış membran bileşenleri enfeksiyon sürecinde önemli rol oynamaktadır. Bu proteinlerin bazı bölgeleri türler arasında korunmuş olup, çapraz bağışıklık oluşturabilecek potansiyel antijen bölgeleri olarak dikkat çekmektedir. Bu nedenle korunmuş protein bölgelerinin hedeflenmesi, çoklu türlere karşı etkili aşı stratejileri geliştirilmesinde önemli bir yaklaşım olarak değerlendirilmektedir. Günümüzde kullanılan aşı stratejileri çoğunlukla belirli Bordetella türlerine yönelik olup, farklı türler arasında yeterli çapraz koruma sağlayamamaktadır. Ayrıca bazı mevcut aşıların oluşturduğu bağışıklık yanıtının zamanla azalması ve tekrar enfeksiyonların görülmesi, daha geniş kapsamlı ve uzun süreli koruma sağlayabilecek yeni nesil aşı stratejilerine olan ihtiyacı artırmaktadır. Bu nedenle, birden fazla Bordetella türüne karşı etkili koruma sağlayabilecek, korunmuş antijenik bölgeleri hedef alan rasyonel aşı tasarımları büyük önem taşımaktadır. Aşıların etkinliği büyük ölçüde oluşturdukları bağışıklık yanıtının kalitesi ve süresi ile ilişkilidir. Etkili bir aşının hem humoral hem de hücresel bağışıklık yanıtını uyarabilmesi gerekmektedir. B hücreleri tarafından üretilen antikorlar patojenlerin nötralizasyonunda rol oynarken, T hücreleri enfekte hücrelerin ortadan kaldırılmasında kritik öneme sahiptir. Aynı zamanda uzun süreli koruma sağlayabilmek için hafıza hücrelerinin oluşması gerekmektedir. Bu nedenle modern aşı tasarımlarında hem B hücresi hem de T hücresi epitoplarının birlikte değerlendirilmesi önem kazanmaktadır. Geleneksel aşı geliştirme yaklaşımları çoğunlukla patojenin inaktive edilmesi veya belirli protein alt birimlerinin kullanılması esasına dayanmaktadır. Ancak bu yöntemler uzun deneysel süreçler gerektirmekte ve bazen istenmeyen yan etkiler ortaya çıkarabilmektedir. Son yıllarda genom dizileme teknolojilerinin gelişmesi ve biyoinformatik analiz araçlarının yaygınlaşması ile birlikte, aşı geliştirme süreçlerinde hesaplamalı yöntemlerin kullanımı önem kazanmıştır. Tersine vaksinomik ve immünoinformatik yaklaşımlar, patojenlerin genomik ve proteomik verilerinin analiz edilmesi yoluyla potansiyel aşı adaylarının deneysel aşamaya geçilmeden önce belirlenmesine olanak sağlamaktadır. Bu çalışmada, dört Bordetella türüne karşı çapraz koruyucu bağışıklık oluşturabilecek çok epitoplu kimerik bir aşı adayının immünoinformatik yaklaşımlar kullanılarak tasarlanması ve deneysel üretime uygunluğunun değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Çalışmanın ilk aşamasında, seçilen türlere ait proteom verileri karşılaştırmalı olarak incelenmiş ve türler arasında korunmuş protein bölgeleri belirlenmiştir. Bu analizler, farklı türlerde ortak olarak bulunan ve bağışıklık sistemi tarafından hedeflenebilecek potansiyel antijen bölgelerinin ortaya konmasını sağlamıştır. Belirlenen proteinler üzerinden gerçekleştirilen epitop tahmin analizleri sonucunda, bağışıklık sistemi tarafından tanınma potansiyeli yüksek bölgeler seçilmiştir. Epitopların seçimi sırasında yalnızca bağlanma gücü değil, aynı zamanda güvenlik parametreleri de dikkate alınmıştır. Böylece potansiyel alerjenik veya toksik etkiler oluşturabilecek bölgeler dışlanmış ve güvenli bir aşı adayının tasarlanması hedeflenmiştir. Tasarlanan epitopların tek bir yapı içerisinde birleştirilmesi sırasında uygun bağlayıcı diziler kullanılmış ve yapısal bütünlüğün korunması amaçlanmıştır. Aynı zamanda immün yanıtı güçlendirebilmek amacıyla adjuvan özellik gösteren diziler konstrüksiyona eklenmiştir. Böylece hem güçlü hem de dengeli bir bağışıklık yanıtı oluşturabilecek bir yapı elde edilmesi hedeflenmiştir. Yapısal modelleme ve doğrulama analizleri sonucunda seçilen adayın biyolojik açıdan kararlı bir yapı sergilediği belirlenmiştir. Moleküler kenetlenme analizleri, aşı adayının bağışıklık sistemi reseptörleri ile güçlü etkileşimler kurabileceğini ortaya koymuştur. Dinamik analizler ise kompleksin stabilitesini desteklemiştir. Bağışıklık simülasyon analizlerinde gözlenen güçlü antikor üretimi, hafıza hücre oluşumu ve sitokin yanıtları, tasarlanan aşının uzun süreli bağışıklık oluşturma potansiyeline sahip olduğunu göstermektedir. Güçlendirme dozlarının bağışıklık yanıtını artırdığı ve daha hızlı ikincil yanıt oluşumuna katkı sağladığı gözlemlenmiştir. Deneysel üretim aşamasında rekombinant proteinin başarılı biçimde üretildiği ve hedeflenen moleküler ağırlıkta protein bantlarının elde edildiği doğrulanmıştır. Proteinin çözünür fraksiyonda bulunması ileride yapılacak saflaştırma ve fonksiyonel analiz çalışmaları açısından önemli avantaj sağlamaktadır. Bu çalışma kapsamında elde edilen bulguların değerlendirilmesi sırasında, immünoinformatik temelli yaklaşımların özellikle çoklu patojen hedefli aşı geliştirme süreçlerinde sağladığı avantajlar açık biçimde görülmüştür. Geleneksel yöntemlerde farklı türlere karşı ayrı ayrı aşı geliştirilmesi gerekebilirken, önemli epitop bölgelerinin seçilerek tek bir konstrüksiyon içerisinde birleştirilmesi, üretim ve uygulama süreçlerinin sadeleştirilmesine katkı sağlayabilecek bir yaklaşım sunmaktadır. Bu durum, özellikle veterinerlik uygulamalarında farklı türlerde görülen solunum yolu enfeksiyonlarının kontrolünde maliyet ve lojistik açıdan önemli avantajlar sağlayabilir. Ayrıca çalışmada kullanılan epitop seçim kriterlerinin yalnızca bağlanma gücü ile sınırlı tutulmaması, aynı zamanda güvenlik parametrelerinin de dikkate alınması önem taşımaktadır. Potansiyel alerjenik veya toksik bölgelerin erken aşamada elenmesi, ileride gerçekleştirilecek deneysel çalışmalar sırasında ortaya çıkabilecek risklerin azaltılmasına katkı sağlayabilir. Bu yaklaşım, hesaplamalı analizlerin yalnızca aday seçimi değil, aynı zamanda güvenlik öngörüsü açısından da değerli araçlar sunduğunu göstermektedir. Yapısal analiz sonuçları değerlendirildiğinde, seçilen epitopların konstrüksiyon içerisinde uygun biçimde konumlandırılması ve protein katlanmasının korunması, bağışıklık sistemi tarafından doğru tanınmanın sağlanması açısından önemli bir avantaj sunmaktadır. Yanlış katlanmış protein yapıları bazen beklenen immün yanıtı oluşturamayabilmekte veya üretim sırasında agregasyon sorunlarına yol açabilmektedir. Bu nedenle modelleme ve rafinasyon adımlarında elde edilen olumlu sonuçlar, tasarımın üretilebilirliği açısından önemli bir gösterge olarak değerlendirilmektedir. Moleküler kenetlenme analizleri yalnızca bağlanma varlığını değil, aynı zamanda bağlanmanın niteliğini de ortaya koymaktadır. Kompleks oluşumu sırasında gözlenen etkileşim türleri ve bağlanma yüzeylerinin genişliği, reseptör aktivasyonunun potansiyel gücüne dair ipuçları sunmaktadır. Bu tür analizler, aşı adaylarının doğuştan gelen bağışıklık sistemini uyarma kapasitesini önceden tahmin etme açısından önemli bilgiler sağlamaktadır. Bağışıklık simülasyon analizlerinde elde edilen sonuçlar, özellikle tekrar doz uygulamaları sonrası gelişen yanıtın daha hızlı ve güçlü olması açısından dikkat çekicidir. Bu durum bağışıklık hafızasının oluştuğunu ve gelecekte patojen ile karşılaşılması durumunda organizmanın daha etkili bir savunma geliştirebileceğini göstermektedir. Simülasyon sonuçları aynı zamanda antikor sınıf değişiminin gerçekleştiğini ve bağışıklık yanıtının zaman içerisinde olgunlaştığını ortaya koymaktadır. Deneysel üretim aşamasında elde edilen bulgular, hesaplamalı olarak tasarlanan yapıların laboratuvar ortamında üretilebilirliğini göstermesi açısından önemli bir aşamayı temsil etmektedir. Protein üretim süreçlerinde sıklıkla karşılaşılan sorunlardan biri hedef proteinin çözünmeyen agregatlar halinde birikmesidir. Bu çalışmada proteinin kısmen çözünür fraksiyonda da gözlenmiş olması, ileride gerçekleştirilecek saflaştırma ve fonksiyonel analiz çalışmalarının daha kolay yürütülebileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, çalışmanın bazı sınırlılıkları da bulunmaktadır. In silico analizler güçlü öngörüler sunmakla birlikte, gerçek biyolojik sistemlerin karmaşıklığını tamamen yansıtmayabilir. Bu nedenle tasarlanan aşı adayının gerçek bağışıklık yanıtını ne ölçüde tetikleyeceği ancak deneysel hayvan modellerinde gerçekleştirilecek çalışmalar sonucunda kesin biçimde değerlendirilebilecektir. Ayrıca farklı konak türlerinde bağışıklık yanıtlarının değişkenlik gösterebileceği de dikkate alınmalıdır. Gelecekte gerçekleştirilecek çalışmalar kapsamında, üretilen rekombinant proteinin saflaştırılması, immünizasyon deneyleri ile antikor üretiminin ölçülmesi ve koruyuculuk düzeyinin değerlendirilmesi planlanabilir. Ayrıca farklı adjuvan kombinasyonları veya taşıyıcı sistemlerin kullanılması ile aşının immünojenitesinin artırılması da mümkün olabilir. Bu tür çalışmalar, tasarlanan adayın pratik uygulamalara dönüştürülmesi açısından kritik öneme sahip olacaktır. Sonuç olarak bu çalışma, immünoinformatik analizler ile deneysel biyoteknolojik yaklaşımların birlikte kullanılması sayesinde rasyonel aşı adaylarının geliştirilebileceğini göstermektedir. Korunmuş epitop bölgelerinin hedeflenmesi, çoklu patojenlere karşı koruma sağlayabilecek yeni nesil aşı stratejilerinin geliştirilmesi açısından umut verici bir yaklaşım sunmaktadır. Bu çalışma ile elde edilen bulgular, yalnızca Bordetella enfeksiyonlarının kontrolü açısından değil, genel olarak modern aşı geliştirme çalışmalarında hesaplamalı yaklaşımların önemini ortaya koyması bakımından da değer taşımaktadır.
Özet (Çeviri)
Bordetella species are an important group of Gram-negative respiratory pathogens that affects both humans and animals. While B. pertussis is the most extensively studied species due to its role in whooping cough, non-pertussis Bordetella species such as B. bronchiseptica, B. avium, B. hinzii, and B. holmesii have importance as significant pathogens, especially in veterinary field and immunocompromised hosts. The limited availability of broadly protective vaccines against these species highlights the need for novel vaccination strategies capable of providing cross-protective immunity. In recent years, advances in immunoinformatics and vaccinomics have enabled the design of vaccine candidates through computational prediction of antigenic determinants. Multi-epitope chimeric vaccines give a promising alternative to conventional whole-cell or subunit vaccines because they allow the selective inclusion of conserved and immunogenic regions while minimizing non-essential or potentially reactogenic components. These kinds of approaches offer improved safety profiles, enhanced immune coverage, and flexibility in targeting multiple species simultaneously. In this study, a multi-epitope chimeric vaccine candidate targeting four Bordetella species (B. avium, B. bronchiseptica, B. hinzii, and B. holmesii) was designed using a comprehensive immunoinformatics-based workflow and subsequently optimized for recombinant production. Initially, conserved antigenic proteins shared among the selected species were identified through comparative sequence analysis. Candidate proteins were further evaluated based on subcellular localization and immunological accessibility. Then, B-cell and MHC class I T-cell epitopes were predicted and screened for antigenicity, non-allergenicity, and non-toxicity. T-cell epitopes were predicted against MHC alleles of Canine spp., and due to the absence of validated canine MHC class II alleles in public databases, MHC class II epitope prediction was not included in the present study. Selected epitopes were assembled into a single chimeric construct by using appropriate linker sequences to preserve epitope integrity and enhance immunogenic presentation. Structural modeling of the designed vaccine construct was performed to evaluate its tertiary structure and stability. Three-dimensional models generated using prediction tools were refined and validated, demonstrating favorable stereochemical properties. Molecular docking analyses with Toll-like receptors (TLR 2 and TLR 4) suggested stable interactions between the vaccine construct and immune receptors. This supports the potential of the designed vaccine to activate both innate and adaptive immune responses. To assess the feasibility of experimental production, the amino acid sequence of the chimeric vaccine was reverse-translated and codon-optimized for expression in Escherichia coli by using the JCAT tool. The optimized gene was cloned into a pET-based expression vector and recombinant expression was evaluated in multiple E. coli strains. Between the tested strains, E. coli T7 gave the most reliable transformation and expression performance and was selected for further optimization studies. Recombinant protein expression was systematically optimized by evaluating induction temperature and IPTG concentration. SDS-PAGE and Western blot analyses confirmed IPTG-dependent expression of the recombinant protein at the expected molecular weight. Comparative analyses revealed that both low and high-temperature induction conditions supported expression. However, induction at 37°C for 4 hours resulted in robust and reproducible protein production. Importantly, fractionation of cell lysates into soluble and insoluble fractions demonstrated that the recombinant protein was also found in the supernatant, indicating favorable solubility. Overall, this study demonstrates the successful integration of immunoinformatics vaccine design with experimental expression. The results confirm that the designed multi-epitope chimeric vaccine candidate can be efficiently produced as a recombinant protein in E. coli. This provides an important experimental foundation for future purification and immunological evaluation studies. This work highlights the potential of vaccine design strategies for developing next-generation vaccines against complex bacterial pathogens. Also, contributes valuable insights toward cross-protective vaccine development for Bordetella species.