Biomimicking cartilage: Engineering the matrix, molecular pathways and oxygen sensing of chondrocytes
Biyomimik kıkırdak: Kondrositlerin matriksi, moleküler yolakları ve oksijen duyarlılığı mühendisliği
- Tez No: 995275
- Danışmanlar: PROF. DR. MARCY ZENOBI-WONG
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyomühendislik, Bioengineering
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2017
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Eıdgenossısche Technısche Hochschule Zurıch (eth)
- Enstitü: Yurtdışı Enstitü
- Ana Bilim Dalı: Biyomedikal Bilimler ve Mühendislik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Biyomalzeme ve Doku Mühendisliği Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Eklem kıkırdak dokusu, avasküler yapısı ve vücudun iyileşme mekanizmalarına sınırlı erişimi nedeniyle kendi kendini onarma yeteneğinden yoksundur. Otolog kondrositlerin kullanımına dayalı mevcut tedavi stratejileri, kusurlu bölgeye implantasyon yapılabilmesini sağlamak üzere yeterli hücre verimini elde etmek için in vitro hücre çoğaltımı gerektirmektedir. Bu tek tabakalı çoğaltımın ardından kondrositler, fibroblastik fenotipin indüksiyonu ve kondrojenik belirteçlerin kaybı ile işaretlenen ve fibrokıkırdak oluşumuna ve başarısız klinik sonuçlara yol açan bir fenomen olan dediferansiyasyona uğramaktadır. Bu tez, kıkırdak mikroortamının özelliklerini ve natif kondrosit fenotipini yöneten hücresel sinyal gönderme mekanizmalarını izah etmeyi ve kıkırdak doku mühendisliğinde kullanılacak biyobenzetim sistemlerini geliştirmeyi amaçlamaktadır. Kıkırdak ekstraselüler matriksi (ECM), hem su tutması yoluyla dokuya basınç kuvveti kazandırmak gibi fiziksel bir role sahip olan hem de aşağı akış sinyal yolaklarını harekete geçiren ligand-reseptör etkileşimlerine aracılık ederek biyolojik bir role sahip olan sülfatlanmış glikozaminoglikanlar (GAG'ler) bakımından benzersiz şekilde zenginleştirilmiştir. Bu tezin ilk bölümünde, kondrosit mikroortamındaki sülfat kısımların rolünü keşfetmek için inert bir biyopolimer olan aljinata dayalı bir biyobenzetim modeli geliştirdik. Aljinatın sülfatlaşmasının, sülfatlaşma derecesine göre doz-yanıt tarzında üç boyutlu (3D) bir bağlamda enkapsüle edilmiş kondrositlerin güçlü çoğalmasını sağladığını gösterdik. Sülfatlanmış hidrojellerde kondrositlerin mitojenitesine, fibroblast büyüme faktörü (FGF) sinyalizasyonuna ait aktivasyonun aracılık ettiği ve bunun biyofiziksel fenomenlerden bağımsız olduğu bulunmuştur. Aljinat sülfat hidrojellerinde yeni izole edilmiş kondrositlerin büyümesi, kıkırdak matriksi bileşenleri tip II kolajen ve agrekanın aşırı birikmesine yol açarken, dediferansiyasyon ve katabolik belirteçler baskılanmıştır. Ayrıca, aljinat sülfatın, aktif bir sinyal matriksi olarak hareket ettiğini ve hücre proliferasyonunu ve dediferansiyasyonun baskılanmasını düzenleyen sinyal olaylarını başlatmak için sülfatlanmış GAG-mimetik tarzda FGF2 ile reseptörü arasında kompleks oluşumunu gerçekleştirdiğini de ortaya serdik. Akut travma veya dejeneratif hastalıklardan kaynaklanan kıkırdak hasarına sıklıkla, dokunun daha da kötüleşmesine yol açan bir inflamasyon indüksiyonu eşlik eder. Bu nedenle, kıkırdak onarımı için tasarlanmış yapılar, implantasyon sonucunda oluşan kusur bölgesinde inflamatuar sitokinler ile zorlanır; bu da matriks kaybına ve rejenerasyonun bozulmasına neden olabilir. Tezin ikinci bölümünde, kondrosit mikroortamında sülfatlaşmanın inflamatuar sinyal yolakları üzerindeki rolünü araştırdık. Kondrositler, inflamasyon üzerindeki interlökin (IL) -1β ile uyarılan etkileri araştırmak için aljinat sülfat ve aljinat hidrojelleri içine alındı. IL-6, IL-8, siklooksijenaz-2 (COX-2) gibi pro-inflamatuar genlerin ve trombospondin tip 1 motifli disintegrin ve metalloproteinaz 5 (ADAMTS5) gibi katabolik genlerin ekspresyonu, sülfatlı hidrojellerin içindeki kondrositlerde önemli ölçüde inhibe edildi. COX-2 ve nükleer faktör kappa B'nin (NF-κB) protein ekspresyonunun yanı sıra NF-κB ve p38 mitojenle aktive olan protein kinazların (p38 MAPK) aktivasyonu, sülfatlanmış hidrojellerde bastırıldı. Ek olarak, aljinat sülfat hidrojellerinin, IL-1ß'ye önemli ölçüde daha yüksek bir afinite sergilediği gözlendi. Bu nedenle, biyobenzer aljinat sülfat hidrojelleri, sitokinlerin sekestrasyonu yoluyla inflamatuar indüksiyonun inhibisyonunu gösterdi ve kapsüllenmiş kondrositler için koruyucu bir mikroortam sağladı. Daha sonra, kıkırdak onarımında kullanım amacıyla in vivo stabilite ve doku entegrasyonunu ele almak için aljinat sülfat hidrojellerinin enjekte edilebilir ve adhesiv bir versiyonunu geliştirdik. Aljinatın sülfat ve tiramin kimyasal gruplarıyla çifte modifikasyonunu ve fizyolojik koşullar altında tirozinaz enzimi eşliğinde in situ enzimatik jelleşme kapasitesini gösterdik. Aljinat sülfat tiramin (ASTA) ve aljinat tiramin (AlgTA) hidrojelleri, enkapsüle edilmiş kondrositlerin canlılığını ve kollajen tip II ve agrekanın üretimi ile kondrojenik rediferasyonu destekledi. Tirozinaz eşliğinde in situ olarak jelleşirken, ASTA ve AlgTA natif kıkırdağa güçlü adhezyon gösterdi. Son olarak, hidrojeller canlı içinde (in vivo) stabilite sergileyerek farelere subkütan olarak yapılan implantasyon üzerine 4 hafta süreyle tamamen bozulmadan kaldı. Daha sonra, kondrosit fenotipini düzenleyen sinyal olaylarını, üç boyutlu kültürleme ve oksijen gerilimi gibi hücresel mikroortamın etkisine vurgu yaparak araştırdık. Rho ve Wnt sinyalizasyonunun rolünü ve bunların kondrosit dediferansiyasyonunda içeriğe bağlı etkileşimlerini araştırdık. Kondrositlerin tek tabakalı çoğaltılması, kondrojenik belirteçlerin kaybıyla konkomitant olarak RhoA'nın artmasına ve nükleer translokasyonuna neden oldu. Dediferansiye kondrositlerde kanonik Wnt sinyalizasyonunun Rho'ya bağımlı bir şekilde aktivasyonu gözlendi. RhoA aktivasyonunun engellenmesi, nükleerizasyonunu bastırdı, hem iki boyutlu hem de üç boyutlu hidrojellerde kondrositlerdeki kondrojenik belirteçlerin yeniden ekspresyonunu tetikledi ve kanonik Wnt sinyalizasyonunun inhibisyonuna neden oldu. Ayrıca, kondrositlerde kanonik Wnt sinyalizasyonunun indüksiyonu, hücresel mikroortama ve RhoA'nın aktivasyon durumuna bağlı olarak kondrojenik belirteçlerin ekspresyonu üzerinde çelişkili etkiler ortaya çıkardı. Son bölümde, hipoksik kıkırdak mikroortamının kondrositlerde Rho ve kanonik Wnt sinyalizasyonunun düzenlenmesindeki rolünü araştırdık. Hipoksinin, RhoA ve β-katenin ekspresyonu üzerinde bağlama bağlı etkiler yarattığını ortaya çıkardık. Üç boyutlu hidrojeller içinde hipoksi, konkomitant sekilde kondrojenik belirteçlerin ekspresyonu ve rediferansiyasyonu ile RhoA ve β-katenin ekspresyonunun inhibisyonuna neden oldu. Tersine, hipoksi, kondrositler iki boyutlu olarak kültürlendiğinde, kondrojenik fenotipin yeniden ekpresyonunda bir başarısızlıkla birlikte RhoA ve β-katenin'in güçlü bir yukarı regülasyonunu tetikledi. Rho veya Wnt sinyalizasyonunun aktivasyonu, kondrojenik belirteçlerin hipoksi ile tetiklenen yeniden ekpresyonunun ortadan kaldırılmasına neden olduğu için, üç boyutlu ortamda hipoksinin Rho ve kanonik Wnt sinyalinin inhibe etmesi, kondrosit rediferasyonunun teşvik edilmesi için çok önemliydi. Hipoksinin Rho ve kanonik Wnt sinyalizasyonu üzerindeki etkileri, hipoksiyle indüklenebilir faktörler (HIF) aracılığıyla sağlandı ve normoksik koşullar altında HIF'lerin stabilizasyonu ile taklit edilebildi. Bu nedenle, bu sonuçlar, oksijen geriliminin, kondrosit fenotipinin üç boyutlu hücresel mikroortam ile sinerji içinde düzenlenmesinde önemli bir faktör olduğunu gösterdi. Sonuç olarak, bu tez, ECM bileşenleri, düşük oksijen gerilimi ve hücre morfolojisi ve mekanotransdüksiyonu kontrol eden sinyalizasyon mekanizmaları gibi kıkırdak mikroortamının natif özelliklerini biyolojik olarak taklit etmenin önemini göstermektedir. Burada açıklanan biyobenzetim stratejileri, farklı hücresel bağlamlarda kondrosit sinyalizasyonunun daha iyi anlaşılmasına ve kıkırdak doku mühendisliğinde kullanılmak üzere yapıların geliştirilmesine olanak sağlamaktadır.
Özet (Çeviri)
Articular cartilage tissue lacks the ability of self-repair due to its avascular structure and limited access to the body's healing mechanisms. Current treatment strategies based on the use of autologous chondrocytes demand in vitro expansion in order to achieve sufficient cell yield for implantation into the defect site. Upon monolayer passaging, chondrocytes go under dedifferentiation, a phenomenon marked by an induction of fibroblastic phenotype and loss of chondrogenic markers, that leads to fibrocartilage formation and impaired clinical outcome. This thesis aims to elucidate the characteristics of the cartilage microenvironment and cellular signaling mechanisms that govern native chondrocyte phenotype and to develop biomimetic systems to be used in cartilage tissue engineering. Cartilage extracellular matrix (ECM) is uniquely enriched in sulfated glycosaminoglycans (GAGs) which have both a physical role such as conferring compressive strength to the tissue via entrapment of water and a biological role through mediating ligand-receptor interactions that initiate downstream signaling pathways. In the first part of the thesis, we developed a biomimetic model based on an inert biopolymer, alginate, to explore the role of sulfate moieties in the chondrocyte microenvironment. We showed that sulfation of alginate drives potent proliferation of encapsulated chondrocytes in a three-dimensional (3D) context in a dose-response manner to the degree of sulfation. Mitogenicity of chondrocytes in the sulfated hydrogels was found to be mediated by activation of fibroblast growth factor (FGF) signaling and independent of biophysical phenomena. Growth of freshly-isolated chondrocytes in alginate sulfate hydrogels led to extensive deposition of cartilage matrix components type II collagen and aggrecan whereas dedifferentiation and catabolic markers were suppressed. We further demonstrated that alginate sulfate acted as an active signaling matrix and facilitated a complex formation between FGF2 and its receptor in a sulfated GAG-mimetic manner to initiate signaling events that regulate cell proliferation and suppression of dedifferentiation. Cartilage damage due to acute trauma or degenerative diseases is frequently accompanied by an induction of inflammation that leads to further deterioration of the tissue. Engineered scaffolds for cartilage repair are thus challenged by inflammatory cytokines in the defect site upon implantation which could promote matrix loss and impairment of regeneration. In the second part of the thesis, we investigated the role of sulfation in the chondrocyte microenvironment on the inflammatory signaling pathways. Chondrocytes were encapsulated in alginate sulfate and alginate hydrogels to explore interleukin (IL)-1β-stimulated effects on inflammation. Expression of pro-inflammatory genes IL-6, IL-8, cyclooxygenase-2 (COX-2) and catabolic genes such as a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin type 1 motifs 5 (ADAMTS5) were significantly inhibited in chondrocytes encapsulated in sulfated hydrogels. Protein expression of COX-2 and nuclear factor kappa B (NF-κB) as well as activation of NF-κB and p38 mitogen-activated protein kinases (p38 MAPK) were suppressed in sulfated hydrogels. Furthermore, alginate sulfate hydrogels were observed to exert a significantly higher affinity to IL-1β. Biomimetic alginate sulfate hydrogels, therefore, demonstrated an inhibition of inflammatory induction via sequestration of cytokines and provided a protective microenvironment for the encapsulated chondrocytes. We then developed an injectable and adhesive version of alginate sulfate hydrogels to address in vivo stability and tissue integration for use in cartilage repair. We demonstrated double modification of alginate with sulfate and tyramine moieties and in situ enzymatic crosslinking with tyrosinase under physiological conditions. Alginate sulfate tyramine (ASTA) and alginate tyramine (AlgTA) hydrogels supported the viability of encapsulated chondrocytes and chondrogenic re-differentiation with an upregulation of collagen type II and aggrecan. ASTA and AlgTA showed strong adhesion to native cartilage while tyrosinase-mediated in situ crosslinking. Finally, the hydrogels were stable in vivo and remained fully intact upon subcutaneous implantation into mice for 4 weeks. We next investigated signaling events that regulate chondrocyte phenotype with an emphasis on the effect of cellular microenvironment such as 3D culturing and oxygen tension. We explored the role of Rho and Wnt signaling and their context-dependent cross-talk in chondrocyte dedifferentiation. Monolayer expansion of chondrocytes caused an upregulation and nuclear translocation of RhoA with concomitant loss of chondrogenic markers. An activation of canonical Wnt signaling in a Rho-dependent manner was observed in dedifferentiated chondrocytes. Inhibiting RhoA activation suppressed its nuclearization, induced re-expression of chondrogenic markers in chondrocytes both on 2D and in 3D hydrogels and led to inhibition of canonical Wnt signaling. Moreover, induction of canonical Wnt signaling in chondrocytes revealed contradictory effects on the expression of chondrogenic markers depending on cellular microenvironment and the activation state of RhoA. In the last part, we explored the role of hypoxic cartilage microenvironment in the regulation of Rho and canonical Wnt signaling in chondrocytes. We found that hypoxia exerted context-dependent effects on the expression of RhoA and β-catenin. Within 3D hydrogels, hypoxia caused an inhibition of RhoA and β-catenin expression with concomitant redifferentiation and expression of chondrogenic markers. Conversely, hypoxia induced a potent upregulation of RhoA and β-catenin when chondrocytes were cultured on 2D accompanied with a failure in re-expression of chondrogenic phenotype. Hypoxia-induced inhibition of Rho and canonical Wnt signaling in 3D was crucial for the promotion of chondrocyte redifferentiation since activation of Rho or Wnt signaling caused an abrogation of hypoxic re-expression of chondrogenic markers. The effects of hypoxia on Rho and canonical Wnt signaling in chondrocytes were mediated via hypoxia inducible factors (HIF) and could be mimicked by stabilization of HIFs under normoxic conditions. Therefore, these results pointed out oxygen tension as an important factor in regulation of chondrocyte phenotype in synergy with 3D cellular microenvironment. In conclusion, this thesis demonstrates the importance of biomimicking the native characteristics of the cartilage microenvironment such as ECM components, low oxygen tension and signaling mechanisms involved in cell morphology and mechanotransduction. The biomimetic strategies explained here lead to a better understanding of chondrocyte signaling in different cellular contexts as well as development of scaffolds for use in cartilage tissue engineering.
Benzer Tezler
- Biyohibrid yapılı ve biyotaklitçi polimer-peptid konjugatlarının geliştirilmesi
Improving of biohybrid and biomimicking polymer-peptide conjugates
BANU MANSUROĞLU
- Kanser tedavisinde ve moleküler görüntülemede kullanılması için sentezlenen radyoaktif işaretli yeni bir aşı polimerininin albino wistar sıçanlar üzerinde radyofarmasötik potansiyelinin incelenmesi
Investigation of radiopharmaceutic potential of a new radiolabeled graft polymer for using in the therapy and in the molecular imaging on albino wistar rats
BUKET ATEŞ
Yüksek Lisans
Türkçe
2018
KimyaManisa Celal Bayar ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. UĞUR AVCIBAŞI
- Metabolit tayinine yönelik biyoesinlenmiş nanomalzemelerin geliştirilmesi ve uygulamaları
Development and applications of bioinspired nanomaterials for metabolite detection
ERDOĞAN ÖZGÜR
Doktora
Türkçe
2016
BiyokimyaHacettepe ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ADİL DENİZLİ
DOÇ. DR. LOKMAN UZUN
- Spider orb web, investigating structuralfeatures and using biomimicry for latticedesign
Örümcek daıresel ağının yapısalözelliklerinin araştırılması ve kafestasarımı için bıyomimikri kullanılmasıüzerıne
KORAY YAVUZ
Doktora
İngilizce
2025
Biyofizikİhsan Doğramacı Bilkent ÜniversitesiMalzeme Bilimi ve Nanoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
DOÇ. DR. SEYMUR JAHANGIROV
DOÇ. DR. RECEP MUHAMMET GÖRGÜLÜARSLAN
- Bıo-ınspıred desıgn of responsıve facades: A proposal for a foldable facade module
Biyo-esinli tepkisel cephe tasarımı: Katlanabilir bir cephe modülü önerisi
BÜŞRA BİLMEZ