Effect of extreme conditions on enzyme profiles:cytochrome P450 systems as a case study
Ekstrem koşulların enzim profilleri üzerindekietkisi: sitokrom P450 sistemleri
- Tez No: 995033
- Danışmanlar: PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyokimya, Biyoteknoloji, Biyofizik, Biochemistry, Biotechnology, Biophysics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2026
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Mikroorganizmaların yüksek sıcaklık, yüksek tuzluluk, aşırı pH veya ağır metaller gibi toksik kimyasal içeriğe sahip ortamlarda yaşayabilmesini sağlayan enzimler, klasik mezofilik homologlarına kıyasla belirgin düzeyde artmış yapısal kararlılık, geniş substrat yelpazesi ve çoğu zaman sıra dışı katalitik özellikler sergilemektedir. Bu nedenle ekstremozimler, hem protein evriminde seçilim baskılarının anlaşılması hem de zorlu proses koşullarında çalışabilen biyokatalizörlerin geliştirilmesi açısından önemli bir kaynak olarak değerlendirilmektedir. Ekstremofiller de dâhil olmak üzere doğadaki mikroorganizmaların yalnızca yaklaşık %1'inin kültüre edilebilmesi, yeni biyomoleküllerin keşfi ve niş habitatların mikrobiyal çeşitliliğinin aydınlatılması metagenomik yaklaşımların yaygın biçimde kullanılmasına yol açmıştır. Çevresel DNA'nın (eDNA) shotgun ve amplicon yöntemler ile dizilenmesi, kompleks mikrobiyal toplulukların taksonomik bileşiminin yanı sıra fonksiyonel gen repertuarını, özellikle de evrimsel açıdan önemli enzim ailelerinin çevresel dağılımını incelemeye olanak tanıyan metadatanın elde edilmesini sağlamıştır. Bu enzim ailelerinden biri olan sitokrom P450 (P450) süperailesi, heme-tiyolat merkezli monooksijenazlar olarak çok çeşitli substratlar üzerinde stereo- ve regio-selektif oksidasyon reaksiyonları gerçekleştirebilmektedir. Dokuz basamaklı katalitik döngüleri, elektronların uygun redoks partnerleri aracılığıyla heme merkezine aktarılmasıyla başlar; O₂'nin adım adım indirgenmesiyle oluşan yüksek değerlikli ara ürünün (Compound I), substrattan ürünü oluşturması ile başa döner. P450 enzimleri, elektron transfer düzeneklerine göre on redoks sınıfı (I–X) altında sınıflandırılmakta; bu sınıflar, ferredoksin tabanlı üç bileşenli sistemlerden, membrana bağlı redüktazlara veya kendi redüktaz 'domainini' taşıyan füzyon proteinlerine kadar geniş yapısal çeşitlilik göstermektedir. Çok çeşitli olmalarına rağmen neredeyse tüm P450'ler, gömülü bir 'heme' grubunu koordine eden korunmuş sistein kalıntısı, katalitik çekirdeği stabilize eden heliks yapıları ve substrat girişini düzenleyen esnek döngü bölgeleriyle tanımlanan ortak bir üç boyutlu katlanma modelini paylaşmaktadır. Mikrobiyal P450'ler son yıllarda artan genom dizileme çalışmaları sayesinde bakteriler ve arkeler başta olmak üzere birçok mikroorganizma grubunda yaygın biçimde tanımlanmıştır. Özellikle bakteri genomlarında çok sayıda yeni P450 ailesi ortaya konmuş; bu enzimlerin çeşitliliği, organizmanın filogenetik konumu ve yaşadığı ekolojik nişle yakından ilişkilendirilmiştir. Arkelerde ise P450 çeşitliliği daha sınırlı olup, yalnızca bazı ailelerin bakterilerle ortak olarak taşındığı ve bu durumun sınırlı yatay gen transferi (HGT) ile açıklanabileceği düşünülmektedir. Genel olarak, mikrobiyal P450 enzimleri yağ asidi ve alkan oksidasyonu, terpen hidroksilasyonu, aromatik halka fonksiyonlandırması ve sekonder metabolit sentezi gibi geniş bir işlevsel çeşitlilik sergilemekte; bazı özgün bakteri enzimleri ise klasik redoks zincirlerinden bağımsız çalışan peroksijenazlar, nitrasyon yapan sistemler veya oksidatif çapraz bağlama gibi reaksiyonlarla dikkat çekmektedir. Hem temel biyoloji hem de biyoteknoloji açısından dikkat çeken ekstrem P450 enzim sistemleri arasında en yaygın olarak çalışılanlar, termostabil özellik gösterenlerdir. Örneğin, Sulfolobus türlerinden elde edilen CYP119 ve CYP231A2 gibi termoasidofilik arkeal enzimler, sırasıyla yaklaşık 91 °C ve 60 °C'ye kadar erime sıcaklıklarına (Tm) sahip olup, düşük pH koşullarında peroksidaz ve monooksijenaz aktivitelerini koruyabilmektedir. Benzer şekilde, CYP116B ailesine ait bazı self-sufficient termofilik enzimler (örneğin CYP116B46, CYP116B64) 60 °C civarında aktivite gösterebilmekte ve harici redoks partnerlerine ihtiyaç duymadan çalışabilmektedir. Halofilik ortamlara uyum sağlamış P450 enzimleri arasında ise arkelerden CYP174A1 (Halobacterium salinarum) ve bakterilerden OleT_JH, OleT_SQ gibi CYP152 ailesi üyeleri öne çıkmaktadır. Bu enzimler, yüksek tuz konsantrasyonlarında dahi yağ asidi türevlerini terminal alkenlere dönüştürebilmekte olup, biyoyakıt üretimi gibi uygulamalarda potansiyel biyokatalizörler olarak değerlendirilmektedir. Doğada yer alan eşsiz kaynakların açığa çıkartılmasına olanak sağlayan shotgun metagenomik yöntem ile ekstrem ortamlardan yeni ve beklenmedik substrat profillerine sahip P450 enzimlerinin keşfedilmesi, ekstrem ortamlarda şekillenen yapısal ve işlevsel adaptasyonların ortaya konmasını sağlamakta ve bu özelliklere sahip enzimlerin biyoteknolojik uygulamalara taşınmasına imkân tanımaktadır. Söz konusu potansiyeli değerlendirmek amacıyla gerçekleştirilen bu çalışmada ilk olarak, Türkiye'nin farklı ekstrem ekosistemlerinin (Armutlu, Balıkesir-Hisaralan hiper termal bölgeler, Acıgöl, Tuz gölü ve Balıkesir-Gömeç yüksek tuzlu bölgeler ve Balıkesir-Balya asit maden sahası) P450 repertuarı metagenomik yaklaşım ile detaylı olarak incelenmiştir. Bu metagenomik taramanın ardından, ikinci aşama olarak CYP109 ailesi içinden temsilci enzimler seçilmiş ve yapısal/ fonksiyonel karakterizasyonları karşılaştırılmalı olarak gerçekleştirilmiştir. Altı farklı ekstrem bölgeden elde edilen örneklerden çevresel DNA'nın izolasyonunu takiben, shotgun metagenomik analiz 'de novo bining', filogenetik analiz ve fonksiyonel gen anotasyonu yöntemleri ile 87 aile ve 158 alt aileye ait olmak üzere toplam 311 aday P450 dizisi tanımlanmıştır. Bu dizilerden 8'i yeni aile, 49'u ise yeni alt aile olarak sınıflandırılmış; 237 tanesi 138 metagenomik bin içerisinde yer almakta olup, bunlardan 45'i yüksek kaliteli metagenomdan türetilmiş genom (MAG) olarak değerlendirilmiştir. Metagenomik profiller, her bir ekstrem bölgenin mikrobiyal topluluk yapısının belirgin biçimde farklılaştığını ve özellikle belirli filum ve sınıfların sıcaklık, tuzluluk veya pH gibi çevresel parametrelere bağlı olarak zenginleştiğini göstermiştir. Benzer bir örüntü, P450 çeşitliliği ve baskın P450 aileleri açısından da gözlemlenmiştir. Hem primer hem de sekonder metabolizmalarda görev aldığı bilinen CYP107 ailesi tüm sahalarda ortak olarak saptanırken; terpen, steroid ve yağ asitlerinin hidroksilasyonunda görev alan CYP109 ve CYP174 aileleri hipersalin ortamlarda; sterol yan zincir oksidasyonu ve sekonder metabolitlerle ilişkili CYP125 ve CYP197 aileleri hidrotermal sahalarda; alkil zincir ve aromatik hidrokarbon hidroksilasyonu ile ilişkilendirilen CYP108 ve CYP153 ise asidik maden drenajı sahasında baskın olarak bulunmuştur. Her bir ailenin bilinen katalitik özellikleri, bulundukları ekstrem çevresel koşullarla tam olarak örtüşmese de mikrobiyal P450'lerin bilinenin ötesinde reaksiyon tipleri ve substratları katalizleyebildiği göz önüne alındığında, bu enzimlerin ortam koşullarına adaptasyonda dolaylı veya doğrudan rol oynadığı düşünülmektedir. Ayrıca, toplam P450 sayısı ile çeşitlilik arasında doğrudan bir korelasyon saptanmamış olsa da çevresel stresin artmasına paralel olarak P450 çeşitliliğinin arttığı gözlenmiştir. Bu durum, ekstrem koşullarda yaşayan mikroorganizmaların hayatta kalabilmek ve çevreye uyum sağlayabilmek için daha geniş bir P450 repertuarına ihtiyaç duyduğunu düşündürmektedir. Metagenom yöntem ile tanımlanan bu yeni ekstrem P450'lerden, ekstrem ortamların yapı ve fonksiyon üzerine etkisini incelemek üzere CYP109 ailesi seçilmiştir. Bu aile hem bakteri hem de arkea genomlarında tanımlanmış olması nedeniyle evrimsel geçişi yansıtan bir grup olarak dikkat çekmekte, hem de literatürde steroidler ve hidrofobik moleküller üzerinde regio- ve stereoselektif hidroksilasyon yapabilen geniş substrat yelpazesi ile bilinmektedir. Bu özellikleri nedeniyle CYP109 ailesi, yapı–işlev ilişkilerinin ve ekstrem çevreye adaptasyon stratejilerinin incelenmesi için uygun bir model oluşturmaktadır Tanımlanan altı CYP109 üyesi arasından, termofilik CYP109J8 ve hipersalin kökenli CYP109G35 detaylı analiz için seçilmiştir. Her iki enzim de korunmuş P450 motiflerine sahip olmasına rağmen, sırasıyla sınıflandırılamamış bakteriyel ve arkeal metagenomik binlerden elde edilmiştir. Bu enzimlerin cins veya familya düzeyinde taksonomik olarak tanımlanamamış olması, daha önce karakterize edilmemiş ya da düşük temsil edilen mikrobiyal soyları işaret etmekte ve bilimsel açıdan özgünlüklerini artırmaktadır. Biyokimyasal karakterizasyon ve yapısal analizler için, CYP109J8 ve CYP109G35 enzim genleri sentetik olarak üretilmiş, E. coli ekspresyonu için kodon-optimize edilmiş ve pET tabanlı vektörlere klonlanmıştır. Heterolog protein ekspresyonu, uygun indüksiyon ve yetiştirme koşulları altında gerçekleştirilmiş; Ni²⁺-afinite kromatografisiyle yüksek saflıkta protein elde edilmiştir. UV-görünür bölge spektroskopisi ile her iki enzimin de tipik P450 Soret bandı sergilediği doğrulanmış; CO-fark spektroskopisi ile 450 nm civarında maksimum veren aktif P450 formu tespit edilmiştir. Dairesel dikroizm (CD) spektroskopisi kullanılarak ikincil yapı içeriği ve termal erime profilleri belirlenmiş; artan NaCl derişimlerinde hem CYP109J8 hem de CYP109G35 için ikincil yapıların korunduğu ve erime sıcaklıklarının yükseldiği gösterilmiştir. Bu sonuçlar, özellikle CYP109G35 için belirgin bir halo-adaptif profil ortaya koyarken, CYP109J8'in de düşük ve orta tuzluluk koşullarında çözünürlüğünü koruyan halo-tolerant bir enzim olduğunu göstermiştir. Böylece her iki enzimin de ekstrem çevresel parametrelere uyumlu, yapısal olarak kararlı ve biyokimyasal olarak işlevsel olduğu ortaya konmuştur. Bu aşamadan sonra substrat tarama çalışmaları gerçekleştirilmiş; yağ asitleri, terpenler ve steroidler gibi çeşitli ve geniş bir substrat havuzuna karşı test edilen enzimlerin yalnızca vitamin D₂ üzerinde yüksek dönüşüm verimi ve belirgin seçicilik sergilediği gözlenmiştir. Ispanaktan saflaştırılmış ferredoksin ve ferredoksin-NADP⁺ redüktaz (FNR) kullanılarak oluşturulan sistemle yürütülen in vitro biyotransformasyon deneylerinde, CYP109J8 ve CYP109G35 enzimlerinin vitamin D₂'yi sırasıyla %75 ve %82,5 oranında dönüştürebildiği gösterilmiştir. Oluşan ürünler, yüksek çözünürlüklü sıvı kromatografisi–kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) ile analiz edilmiştir. Analizler, her iki enzim için de vitamin D₂'den sırasıyla 25-hidroksivitamin D₂, ardından bu ara üründen elde edilen 1,25-dihidroksivitamin D₂ ve 24-okso-1,25(OH)₂D₂ olduğu düşünülen bir üçüncü metabolitin oluştuğunu göstermiştir. Referans standartlarla karşılaştırmalar ve MS/MS fragmentasyon desenleri, bu ürünlerin kimliklerini desteklemiştir. Kantitatif değerlendirmeler sonucunda, nihai ürün miktarları birbirine yakın olmakla birlikte, CYP109G35 enziminin ilk basamak olan C25-hidroksilasyonu; CYP109J8'in ise ikinci basamak olan C1-hidroksilasyonu daha hızlı gerçekleştirdiği belirlenmiştir. Biyokimyasal sonuçların yapısal temellerini anlamak amacıyla, CYP109J8 ve CYP109G35 enzimlerinin kristal yapıları çözümlenmiştir. Her iki enzim de substratsız halde kristalize edilerek sırasıyla 2.28 Å (CYP109J8) ve 1.50 Å (CYP109G35) çözünürlükte çözülmüş, referans P450'ler ile karşılaştırılmış ve tipik P450 katlanmasının korunduğu gösterilmiştir. Heme grubu I ve L heliksleri arasında konumlanmakta, proksimal tarafta konservatif Cys–Fe (J8: Cys335, G35: Cys355) koordinasyonu gözlenmektedir. Statik koşullarda CYP109J8'de heme prostatik grubunun distal tarafında suyun bağlanacağı“altıncı koordinasyon”pozisyonunun, BC döngüsü üzerinde yer alan His67 tarafından sterik olarak kapatıldığı görülmüştür. Buna karşılık CYP109G35'te distal tarafta su molekülü altıncı ligand olarak koordine olmaktadır. Aktif bölge cepleri genel olarak hidrofobiktir; J8 ve G35 arasında yalnızca birkaç pozisyonda (örneğin J8'de Ile374 ↔ G35'te Phe393, Leu73 ↔ Met90) küçük yan zincir farklılıkları bulunmaktadır. Substrat erişim kanalı (SAC) her iki enzimde de huni şeklindedir ve BC döngüsü, F/G bölgesi ve I heliksi tarafından şekillendirilmektedir. Yapısal karşılaştırmalar, CYP109A2, CYP109E1 ve CYP107Vdh ile aynı global P450 iskeletinin paylaşıldığını, ancak kanal mimarisi bakımından belirgin biçimde ayrıştıklarını göstermiştir. CYP109G35, karşılaştırılan tüm enzimler arasında en uzun ve içe doğru bükülen BC döngüsüne sahiptir; CYP109J8'in BC döngüsü biraz daha kısa olsa da referans enzimlerden uzundur. Hem CYP109G35'te hem de CYP109J8'de BC ve FG döngülerinin kanala doğru eğilmesi SAC'ın daralmasına yol açmaktadır. CYP109J8'de ek olarak G heliksi de distal aktif bölgeye doğru yönelirken, CYP109G35'te N-terminal döngü 'heme' üzerine doğru katlanmakta ve C-terminal döngü aktif bölgeye daha yakın konumlanmaktadır. Bu özellikler birlikte değerlendirildiğinde, her iki enzimin de referans enzimlere kıyasla daha dar bir hidrofobik kanal mimarisine sahip olduğu söylenebilir. Halo-tolerans ve termal stabilite, NaCl2 konsantrasyonuna bağlı CD deneyleri ile incelenmiştir. 0–4 M NaCl aralığında her iki enzim de tipik α-helikal CD imzasını korumuş, bu da yüksek tuzda dahi global katlanmanın bozulmadığını ve enzimlerin halo-tolerant özellik sergilediğini göstermiştir. Termal erime eğrileri, tuz arttıkça Tₘ değerlerinin yükseldiğini ortaya koymuştur: CYP109J8 için Tₘ, 0.5 M'da 68 °C'den 2–4 M'da 73 °C civarına çıkarken; CYP109G35 için 0.5 M'da 76 °C'den 4 M'da 83.7 °C'ye kadar yükselmiştir. Tuzsuz koşullarda her iki enzim de“atipik”erime profilleri sergilerken, yüksek tuzla birlikte daha kooperatif ve klasik bir erime davranışı gözlenmiştir. Termal ve tuza bağlı stabiliteyi yapısal bağlamda açıklamak üzere, amino asit kompozisyonu, hidrofobik ve aromatik temas yoğunluğu, tuz köprüsü sayıları ve yüzey yük dağılımı nicel olarak analiz edilmiştir. CYP109J8, çok yüksek hidrofobik kalıntı oranı (100 aa'da 67.53) ve alanin zenginliği (100 aa'da 11) ile klasik“hidrofobik çekirdek + alanin”temelli termal stabilite modeline uymakta; buna karşın tuz köprüsü (SB) yoğunluğu daha ılımlı kalmaktadır (37 SB; 100 aa'da 9.53). CYP109G35 ise daha düşük genel hidrofobiklik (100 aa'da 49.26), ancak en yüksek aromatik temas yoğunluğu (100 aa'da 11.06) ve çok yoğun bir tuz köprüsü ağı (68 SB; 100 aa'da 16.66) ile tanımlanmakta; bu değerler termofilik referans CYP119A1 ile benzer düzeydedir. Yüzey elektrostatik analizleri, CYP109G35'in net yüzey yükünün oldukça negatif (yaklaşık −22.09·10⁻⁴ e/Ų) ve halofilik referans CYP174A1'e çok yakın olduğunu; CYP109J8'in ise orta düzeyde negatif (−8.13·10⁻⁴ e/Ų) olduğunu göstermiştir. Tuz köprüsü ağ haritaları, CYP109G35'te FG/BC bölgesi ve kanal çevresini saran sürekli, kemer benzeri bir SB ağı bulunduğunu; CYP109J8'de ise daha parçalı, kümelenmiş SB bölgeleri yer aldığını ortaya koymuştur. Bu nedenle CYP109G35'in yüksek tuzda belirgin biçimde stabilize olması ve düşük tuzda daha az kooperatif erime göstermesi, yoğun negatif yüzey yükü ve sık tuz köprüsü ağının iyonik şiddete bağımlı olarak“halo-adaptif”şekilde gerçekleşmesi ile açıklanırken. CYP109J8'te ise stabilitenin esas olarak kompakt hidrofobik çekirdekten kaynaklandığı ve bu nedenle tuza verilen yanıtın daha sınırlı olduğu düşünülmektedir. CYP109G35 ve CYP109J8 üzerinde gerçekleştirilen moleküler dinamik simülasyonları, enzimin vitamin D₂ bağlandığında nasıl yeniden düzenlendiğini ve deneysel olarak gözlenen C25 ağırlıklı regio-selektivitenin dinamik temellerini ortaya koymuştur. Substratsız formda 300 ns'lik simülasyon boyunca omurga RMSD değerlerinin geç döneme kadar kademeli olarak artmaya devam ettiği, buna karşın VD₂ bağlı durumda RMSD'nin ilk 25 ns içinde plato yaparak daha dar bir konformasyonel uzayın stabilize edildiği görülmüştür. Beş farklı başlangıç konformasyonunun karşılaştırılması, CYP109G35 için yalnızca MD2 modelinde, CYP109J8 için ise MD4 modelinde C25 karbonunun uzun süreli ve kararlı bir“yakın-atak”geometrisinde (uygun Fe–C uzaklığı ve Fe–C–H açısı) tutulduğunu; C24 için ise daha kısa süreli fakat tekrarlayan reaktif konformasyonların bulunduğunu, C26–C28 için ise üretken geometriye hemen hiç erişilemediğini göstermiştir. VD2 bağlanması ve etrafındaki amino asitlerin analizi, bu regio-selektif desenin loop dinamikleri ve yerel etkileşim mimarisiyle uyumlu olduğunu göstermiştir. CYP109G35'te VD₂ bağlanması, özellikle G heliksi ve FG loop bölgesinde dalgalanmaların azalmasıyla, substrat erişim kanalının daralarak daha“kilitlenmiş”bir huni mimarisine geçmesine yol açmıştır. Secosteroid çekirdeğin hidrofobik bir kıskaç içinde tutulması ve A halkası–Gln191 arasındaki hidrojen bağı, C25'in heme merkezine yönelik konumunu uzun süreler boyunca koruyan rijit bir bağlanma modu ile uyumludur ve ilk basamakta 25-OH-D₂'nin hızlı üretimini açıklamaktadır. Buna karşılık CYP109J8'de VD₂ bağlanması, FG loop'ta daha sınırlı, BC loop'ta ise belirgin bir hareketlenmeye neden olmuş; BC loop'un açılıp yeniden konumlanması, Tyr276'nın A halkası ile yüz yüze etkileşimi ve hidrofobik/polar temasların birlikte yer aldığı daha esnek bir cep mimarisi oluşturmuştur. Bu daha“dağıtılmış”ve esnek bağlanma düzeninin, 25-OH-D₂ oluşumunun ardından substratın aktif bölgede yeniden oryante olmasına ve ikinci hidroksilasyon basamağı için uygun geometriyi bulmasına imkân tanıdığı; buna karşın G35'in daha sıkı bağlanma modunun yeniden konumlanmayı sınırlayarak çift hidroksillenmiş ürün birikimini görece azaltabileceği düşünülmektedir. Böylece, MD sonuçları hem vitamin D₂'ye karşı yüksek seçiciliğin hem de C25 merkezli regio-selektif ürün deseninin, yalnızca bağlanma afinitesinden değil, aktif bölgedeki konformasyonel organizasyonun ve zaman içinde sürdürülen yakın-atak geometrilerinin bir bileşkesi olarak ortaya çıktığını göstermektedir. Özetle, Türkiye'deki hidrotermal, hipersalin ve asidik ekstrem habitatlardan elde edilen çevresel DNA örneklerinin shotgun metagenomik analizi ile zengin ve büyük ölçüde daha önce tanımlanmamış bir sitokrom P450 çeşitliliği ortaya konmuş; farklı ortamların kendine özgü P450 aile profilleriyle ayırt edilebilen ekolojik“parmak izleri”taşıdığı gösterilmiştir. Bu geniş tarama içinden seçilen iki enzim, hipersalin Tuz Gölü'nden CYP109G35 ve termofilik sıcak su kaynağından CYP109J8, hem halotolerans ve termal stabilite açısından hem de vitamin D₂'ye karşı mutlak seçicilikleriyle ayrıntılı biyokimyasal, yapısal ve dinamik incelemelere tabi tutulmuştur. Kristalografi, spektroskopi ve moleküler dinamik simülasyonları birlikte değerlendirildiğinde, her iki enzimin de korunmuş bir P450 katalitik çekirdeği üzerinde yükselmekle birlikte, substrat erişim kanalı mimarisi, kapak döngülerinin hareket biçimi ve vitamin D₂'yi aktif bölgede sabitlemek için kullandıkları etkileşim ağları bakımından belirgin biçimde ayrıştığı gösterilmiştir. Bu farklılıkların, deneysel olarak gözlenen C25 ağırlıklı regio-selektif profilleri ve basamak-spesifik ürün oluşum hızları ile tutarlı olduğu ortaya konmuş; böylece VD₂ seçiciliği ve ürün deseninin, ekstrem ortama uyumlu yapısal özellikler ve çözelti-benzeri dinamikler tarafından birlikte belirlendiği gösterilmiştir. Elde edilen bulgular, ekstrem çevre metagenomiklerinin yalnızca yeni P450 dizileri kazandırmadığını, aynı zamanda yüksek stabilite, dar substrat seçiciliği ve kontrollü regio-selektivite gibi endüstriyel açıdan değerli özelliklerin rasyonel biçimde okunup yönlendirilebileceği bir enzim tasarımı platformu sunduğunu ortaya koymaktadır.
Özet (Çeviri)
Extremozymes that enable microorganisms to survive under harsh conditions such as high temperature, high salinity, extreme pH, or toxic chemical loads often display markedly enhanced structural stability, broad substrate scope, and, in some cases, unusual catalytic features compared to mesophilic homologs. Because only a small fraction of environmental microorganisms can be cultured, shotgun metagenomics has become a key strategy for accessing this hidden enzymatic diversity. In this thesis, the cytochrome P450 enzyme (P450) repertoire was investigated across multiple extreme ecosystems in Türkiye, including hyperthermal regions (Armutlu and Balıkesir–Hisaralan), hypersaline habitats (Acıgöl, Tuz Lake, and Balıkesir–Gömeç), and an acidic mine drainage site (Balıkesir–Balya). Following environmental DNA (eDNA) isolation, de novo binning, phylogenetic analyses, and functional annotation enabled the identification of 311 candidate P450 sequences, assigned to 87 families and 158 subfamilies, including 8 putative new families and 49 putative new subfamilies. Among these sequences, 237 were located within 138 metagenomic bins, and 45 bins were classified as high-quality metagenome-assembled genomes (MAGs). Site-specific profiles indicated pronounced differences in microbial community composition and corresponding P450 distributions. While CYP107 was detected across all sites, CYP109 and CYP174 were enriched in hypersaline environments; CYP125 and CYP197 were prominent in hyperthermal habitats; and CYP108 and CYP153 were enriched in the acidic mine drainage site, suggesting that P450 family distributions may reflect niche-associated selective pressures and adaptive needs. To examine how extreme environments shape enzyme structure and function at the molecular level, the CYP109 family was selected as a model due to its occurrence in both bacterial and archaeal lineages and its known ability to catalyze regio- and stereoselective hydroxylation of hydrophobic substrates, including steroids. Among six CYP109 candidates recovered from metagenomic data, two representatives were prioritized for detailed characterization: the thermophilic CYP109J8 and the hypersaline-derived CYP109G35. Genes were synthesized, codon-optimized for E. coli, cloned into pET-based vectors, and proteins were purified by Ni²⁺-affinity chromatography. Typical P450 spectral features were verified by UV–vis spectroscopy, and the catalytically active form was confirmed by CO-difference spectra. Circular dichroism analyses showed that both enzymes preserved α-helical secondary structure between 0–4 M NaCl, and thermal unfolding revealed increased melting temperatures with rising ionic strength, consistent with halo-tolerance/halo-adaptation (with a more pronounced salt-dependent stabilization observed for CYP109G35). Substrate screening against diverse fatty acids, terpenoids, and steroids revealed a striking selectivity: both enzymes showed high activity only toward vitamin D₂ (VD2). In vitro biotransformation using a spinach ferredoxin/FNR electron transfer system resulted in 75% (CYP109J8) and 82.5% (CYP109G35) conversion of vitamin D₂. High-resolution LC–MS/MS analyses confirmed the formation of 25-hydroxyvitamin D₂, followed by 1,25-dihydroxyvitamin D₂, and a third metabolite consistent with 24-oxo-1,25(OH)₂D₂, with comparable final product levels but distinct preferences in the first versus second oxidation step between the two enzymes. To establish the structural basis of these biochemical properties, substrate-free crystal structures were solved at 2.28 Å (CYP109J8) and 1.50 Å (CYP109G35) resolution, confirming the canonical P450 fold and conserved proximal Cys–Fe coordination (Cys335 in J8; Cys355 in G35). A key difference was observed at the distal heme face: in CYP109J8, the sixth coordination site was sterically occluded by His67 on the BC loop, whereas in CYP109G35 a water molecule was coordinated as the distal ligand. The substrate access channel (SAC) exhibited a funnel-like architecture in both enzymes and was primarily shaped by the BC loop, the F/G region, and the I helix. Although CYP109J8 and CYP109G35 shared the canonical global P450 scaffold with reference enzymes (CYP109A2, CYP109E1, and CYP107Vdh), they differed markedly in channel architecture. CYP109G35 displayed the longest and most inward-bent BC loop, whereas the BC loop of CYP109J8 was slightly shorter yet remained longer than those of the reference enzymes. In both proteins, inward displacement of the BC and FG loops narrowed the SAC. Additionally, the G helix in CYP109J8 was oriented toward the distal active-site region. In contrast, in CYP109G35 the N-terminal loop folded toward the heme and the C-terminal loop was positioned closer to the active site. Taken together, these features supported that CYP109J8 and CYP109G35 possess a narrower and more hydrophobic channel architecture relative to the reference P450s. Halotolerance and thermal stability were evaluated by NaCl-dependent CD spectroscopy. Across 0–4 M NaCl, both enzymes retained the characteristic α-helical CD signature, indicating that the global fold remained intact even at high salt. Thermal unfolding profiles revealed a salt-dependent increase in melting temperature (Tₘ): for CYP109J8, Tₘ increased from 68 °C at 0.5 M NaCl to 73 °C at 2–4 M NaCl, whereas for CYP109G35, Tₘ rose from 76 °C at 0.5 M NaCl to 83.7 °C at 4 M NaCl. Under salt-free conditions, both enzymes displayed atypical melting behavior, which transitioned to a more cooperative and classical unfolding profile at elevated ionic strength. To rationalize salt and temperature dependent stability in structural terms, the amino-acid composition, hydrophobic and aromatic contact density, salt-bridge abundance, and surface charge distribution were quantified. CYP109J8 exhibited a markedly high hydrophobic residue content and alanine enrichment, consistent with a“hydrophobic core + alanine”driven model of thermal stabilization, whereas its salt-bridge density remained moderate. In contrast, CYP109G35 exhibited lower overall hydrophobicity but the highest aromatic contact density and a dense salt-bridge network, accompanied by a strongly negative surface charge comparable to that of a halophilic reference (CYP174A1). Salt bridge network mapping further indicated a continuous, belt-like salt-bridge arrangement surrounding the BC/FG region and the channel perimeter in CYP109G35, while CYP109J8 displayed more clustered and discontinuous salt-bridge patches. Accordingly, the pronounced salt-dependent stabilization of CYP109G35 and its reduced cooperativity at low salt were attributed to ionic strength dependent halo-adaptive features dominated by surface electrostatics and salt bridge networking, whereas stability in CYP109J8 was inferred to rely primarily on a compact hydrophobic core, resulting in a more limited salt response. Molecular dynamics (MD) simulations of CYP109G35 and CYP109J8 further revealed ligand-induced rearrangements that rationalized the experimentally observed C25 biased regioselectivity for vitamin D₂. In the substrate-free state, backbone RMSD increased gradually throughout the 300 ns trajectory, whereas in the VD₂-bound state, RMSD reached a plateau within the first 25 ns, indicating stabilization within a narrower conformational ensemble. Comparison of five independent starting poses showed that only the MD2 model for CYP109G35 and MD4 model for CYP109J8 maintained C25 in a long-lived and stable near-attack geometry (appropriate Fe–C distance and Fe–C–H approach angle), while C24 displayed shorter but recurrent reactive conformations, and productive geometries for C26–C28 were rarely sampled. Analysis of VD₂ binding and the surrounding amino acids showed that the observed regioselective pattern is consistent with loop dynamics and the local interaction architecture. In CYP109G35, VD₂ binding leads to a reduction in fluctuations particularly in the G helix and FG loop region, causing the substrate access channel to narrow and adopt a more“locked”funnel-like conformation. Retention of the secosteroid core within a hydrophobic clamp, together with the hydrogen bond between the A-ring hydroxyl and Gln191, is in line with a rigid binding mode that maintains the orientation of C25 toward the heme center over extended timescales and explains the rapid formation of 25-OH-D₂ in the first reaction step. In contrast, VD₂ binding in CYP109J8 induces only modest changes in the FG loop but a pronounced increase in BC-loop mobility. Opening and repositioning of the BC loop, the face-to-face interaction between Tyr276 and the A ring, and the combined contribution of hydrophobic and polar contacts together create a more flexible pocket architecture. This more“distributed”and flexible binding arrangement is likely to allow the substrate to reorient within the active site after 25-OH-D₂ formation and to find a suitable geometry for the second hydroxylation step. Conversely, the tighter binding mode of G35 may restrict such reorientation and thereby reduce the accumulation of the doubly hydroxylated product. Thus, the MD results indicate that both the high selectivity for vitamin D₂ and the C25-centred regioselective product pattern arise not only from binding affinity, but from a combination of conformational organization within the active site and near-attack geometries that can be sustained over time. In summary, shotgun metagenomic analysis of environmental DNA obtained from hydrothermal, hypersaline, and acidic extreme habitats in Türkiye revealed a rich and largely previously uncharacterized cytochrome P450 diversity, and showed that different environments carry ecological“fingerprints”in the form of distinct P450 family profiles. From this broad survey, two enzymes, CYP109G35 from the hypersaline Salt Lake and CYP109J8 from a thermophilic hot spring, were selected and subjected to detailed biochemical, structural, and dynamic characterization due to their halotolerance, thermal stability, and strict specificity toward vitamin D₂. Evaluation of crystallography, spectroscopy, and molecular dynamics simulations together demonstrated that, although both enzymes share a conserved P450 catalytic core, they differ markedly in substrate access channel architecture, in the behavior of cap-like loops, and in the interaction networks they employ to stabilize vitamin D₂ in the active site. These differences were shown to be consistent with the experimentally observed C25-biased regioselective profiles and step-specific product formation rates, demonstrating that VD₂ selectivity and product distribution are jointly defined by structural features adapted to extreme environments and solution-like dynamics. Overall, the findings indicate that metagenomes from extreme habitats do not only enrich the P450 sequence space, but also provide enzyme scaffolds with high stability, narrow substrate selectivity, and controllable regioselectivity that can be rationally interpreted and exploited as platforms for enzyme design.
Benzer Tezler
- İzmir'de bazı yolların kapatılarak yaya bölgeleri oluşturma da kent peyzajını geliştirme açısından yeniden planlanması üzerinde araştırmalar
Başlık çevirisi yok
BAHAR TÜRKYILMAZ
Yüksek Lisans
Türkçe
1985
Şehircilik ve Bölge PlanlamaEge ÜniversitesiŞehir ve Bölge Planlama Ana Bilim Dalı
- Diyabetus mellitus'da gözlenen mikrovasküler komplikasyonların prostaglandinler ile olan ilişkisi
The Relation of microvaskular complications observed in diabetes mellitus with prostoglandins
CANAN NEBİGİL
Doktora
Türkçe
1985
Eczacılık ve FarmakolojiCumhuriyet ÜniversitesiFarmakoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. YUSUF SARIOĞLU
- Pik demiri ve karbon çeliğinin sulu çözeltiler içindeki korozyon hızının tayini
Determination of the rate of corrosion of the cast iran and carbon steel in the aqueous solutions
EMİNE NAZAN ÜNAL
Yüksek Lisans
Türkçe
1985
Kimya MühendisliğiGazi ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. HAYRİ YALÇIN