Artan ekspresyonu ile akciğer adenokarsinomunda proliferasyona ve invazyona sebep olan TOP2A geninin RISPR/Cas9 teknolojisiyle susturulması
TOP2A gene with increased expression and which causing proliferation and invasion in lung adenocarcinoma silecing by RISPR/Cas9 technology
- Tez No: 961190
- Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ DENİZ SÜNNETÇİ AKKOYUNLU
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Genetik, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Kocaeli Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Tıbbi Genetik ve Moleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler ve Tıbbi Genetik Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Amaç: Küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK), akciğer kanserinin toplam görülme sıklığının yaklaşık %85'ini oluşturur. Son yıllarda KHDAK' nin tanı ve tedavisinde önemli ilerlemeler kaydedilmiş olsa da, tekrarlaması ve yayılması nedeniyle sağ kalım oranları henüz iyileşmemiştir. TOP2A (DNA topoizomeraz IIA), kanserli hücrelerin gelişimi, ilerlemesi, tedavisi ve prognozda önemli bir rol oynar. TOP2A' nın anormal ifadesi, KHDAK' nin proliferasyonu, hareketliliği, invazyonu ve epitel-mezenkimal geçiş (EMT) olaylarıyla ve KHDAK hastalarının kötü prognozu ile yakından ilişkilidir. Bu çalışmada KHDAK' nin alt tipi olan akciğer adenokarsinom (A549) hücrelerinde TOP2A geninin CRISPR/Cas9 teknolojisi kullanılarak susturulması hedeflenmiştir. Yöntem: Hedeflediğimiz bölgeye özgü rehber RNA tasarlandı. Bu rehber RNA sekansı (gRNA) plazmid vektöre aktarıldıktan sonra vektör E. coli bakteri hücresinde çoğaltıldı. Bakteri kültüründen plazmid izolasyonu yapıldı ve plazmid vektörü pozitif yüklü polimer kullanılarak A549 hücrelerine transfekte edildi. Hedef bölgedeki düzenleme dizi analizi Sanger Dizileme yöntemi ile analiz edildi. Ardından RNA izolasyonunu takiben Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile TOP2A gen ifadesi değerlendirildi. Bunun yanında hücre proliferasyonunda yer alan CCND1, hücre döngüsünde yer alan CDK1, TP53, P21 ve apoptozda görevli BAX, BCL2 gen ifadeleri değerlendirildi. Bulgular: A549 hücrelerine CRISPR/Cas9 sistemiyle manipüle edilen TOP2A gen ifadesinin manipüle edilmeyen hücrelere göre azaldığı saptandı. Hücre döngüsü genlerinden CDK1, TP53 ve BCL2 ifadelerinin arttığı, CCND1, P21 ve BAX ifadelerinin azaldığı görüldü. Manipüle edilen TOP2A geninde, çerçeve kayması oluşumu dizi analizi çalışması ile gösterildi. Sonuç: Bu çalışma ile, KHDAK hücrelerinde TOP2A genin CRISPR/Cas9 ile susturulmasıyla hücre döngüsünün olumsuz yönde etkilendiği ve proliferasyonun azaldığı gösterilmiştir. Elde ettiğimiz sonuçlar ile CRISPR/Cas9 teknolojisiyle TOP2A geni hedeflenerek potansiyel tedavi seçeneği olarak değerlendirilebileceği görüşündeyiz. Ayrıca çalışmamızın bu alanda yapılacak diğer çalışmalarda yol gösterici olacağı düşüncesindeyiz.
Özet (Çeviri)
Objective: Non-small cell lung cancer (NSCLC) accounts for approximately 85% of the total incidence of lung cancer. Although significant progress has been made in the diagnosis and treatment of NSCLC in recent years, survival rates have not improved, owing to its recurrence and dissemination. DNA topoisomerase IIA (TOP2A), plays a significant role in the development, progression, treatment and prognosis of cancerous cells. Aberrant expression of TOP2A is closely associated with the proliferation, motility, invasion, and epithelial-mesenchymal transition (EMT) of non-small cell lung cancer (NSCLC) cells, and is also linked to poor prognosis in NSCLC patients. In this study, the silencing of the TOP2A gene was targeted using CRISPR/Cas9 technology in A549 cells, a lung adenocarcinoma cell line and a subtype of non-small cell lung cancer (NSCLC). The aim was to verify the induced mutations by sequence analysis and to evaluate the relative gene expression levels through quantitative real-time PCR (qRT-PCR). Method: We first designed the region-specific guide RNA we are targeting. After this guide RNA sequence (gRNA) was transferred to the plasmid vector, the vector was propagated in the E. coli bacterial cell. Plasmid was isolated from the bacterial culture and the plasmid vector was transfected into A549 cells using a positively charged polymer. The editing in the target region was analyzed by Sanger sequencing. Subsequently, following RNA isolation, the expression level of the TOP2A gene was evaluated using quantitative real-time PCR (qRT-PCR). Furthermore, the expression levels of CCND1, a key regulator of cell proliferation; CDK1, TP53, and P21, which are central to cell cycle regulation; and BAX and BCL2, which are critically involved in apoptosis, were evaluated. Results: CRISPR/Cas9-mediated targeting of the TOP2A gene in A549 cells led to a significant reduction in its expression compared to non-targeted control cells. Gene expression analysis revealed upregulation of CDK1, TP53, and BCL2, while CCND1, P21, and BAX were downregulated. Sanger sequencing confirmed the presence of a frameshift mutation in the TOP2A gene, likely resulting from a CRISPR-induced double-strand break. Conclusion: This study demonstrates that CRISPR/Cas9-mediated silencing of the TOP2A gene in non-small cell lung cancer (NSCLC) cells disrupts cell cycle progression and leads to a reduction in cellular proliferation. Based on our findings, we suggest that targeting TOP2A through CRISPR/Cas9 technology may represent a potential therapeutic approach. Moreover, we believe that our study may serve as a guide for future research in this field.
Benzer Tezler
- 1985-1986 yıllarında Polatlı Devlet Hastanesine kaza nedeniyle başvuranların incelenmesi
Başlık çevirisi yok
FERHAN ŞENOL
Yüksek Lisans
Türkçe
1986
İlk ve Acil YardımGazi ÜniversitesiKazaların Çevresel ve Teknik Araştırması Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
DOÇ. DR. HİKMET PEKCAN
- İzmir'de Mustafa Kemal Bulvarı'nın peyzaj mimarlığı açısından etüdü ve peyzaj projesi
Başlık çevirisi yok
ENGİN ALPARSLAN
Yüksek Lisans
Türkçe
1985
Peyzaj MimarlığıEge ÜniversitesiPeyzaj Mimarlığı Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ÜMİT ERDEM
- Acil yardım ve tedavi hastanelerinin idari mali ve teknik yönden planlaması
Başlık çevirisi yok
SERVET OKUYUCU
Yüksek Lisans
Türkçe
1985
HastanelerGazi ÜniversitesiKazalarda Acil Yardım ve Rehabilitasyon Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. HİKMET PEKCAN
- Katı yakıtların akışkan yatakta yakılması ve katı miktarının yatak yüksekliğine etkisi
Combustion of solid fuels in the fkuidized beds and the effects of solid quantity to the height of bed
KAMİL BEKİR KOÇ
Yüksek Lisans
Türkçe
1987
Makine MühendisliğiGazi ÜniversitesiMakine Eğitimi Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ALİ YÜCEL UYAREL
- Hazar Gölü-Ergani (Elazığ vilyeti) çevresinde yaşayan heteroptera türlerin sistematiği ve ekolojisi üzerine araştırmalar
Siystematich-ökologische untersuchurgen uber die ganzen (heteroptera) ausdem gebiet Hazar-see, maden und Ergani (Prov. Elazığ)
SUAT KIYAK