Targeting circulating breast cancer stem cells via mTOR and WNT inhibitors after bone metastasis
Sirküle meme kanseri kök hücrelerinin kemik metastazı sonrası mTOR ve WNT inhibitörleri ile hedeflenmesi̇
- Tez No: 939225
- Danışmanlar: PROF. DR. BETÜL ÇELEBİ SALTIK
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyokimya, Tıbbi Biyoloji, Moleküler Tıp, Biochemistry, Medical Biology, Molecular Medicine
- Anahtar Kelimeler: Breast cancer stem cell, Temsirolimus, Niclosamide, collagen type I, poly-γ glutamic acid, sodium metasilicate, Meme kanseri, Neoplazm kök hücreleri, Neoplazm metastazları, Meme kanseri kök hücresi, Temsirolimus, Niklozamid, kolajen tip I, poli γ-glutamik asit, sodyum metasilikat, Neoplastic stem cells, Neoplasm metastasis
- Yıl: 2025
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Hacettepe Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Kök Hücre Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Kök Hücre Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Cancer stem cells (CSCs), a rare subpopulation in breast tissue, are strongly associated with tumor progression, distant metastasis and secondary tumor formation. The aim of this thesis is to determine the changes in apoptosis, EMT and stemness properties of CSCs isolated from TNBC MDA-MB-231, after they are localized in a 3D bone-like structure and targeted with Temsirolimus and Niclosamide. A scaffold was fabricated using a 3D printer with PLA filaments and a PU cylindrical vessel-like structure was passed through the scaffold. The interior of the scaffold was coated with a composite material comprising 3.1 mg/mL collagen-I, 3.6 mg/mL poly-γ-glutamic acid, and 500 µM sodium metasilicate. BM-MSCs were seeded within this material and differentiated osteogenically for 21 days. Osteogenic differentiation was confirmed on days 14 and 21 through Alizarin Red staining and calcium quantification. The impacts of 5 µM Temsirolimus (p-mTOR) and 100 µM Niclosamide (p-STAT3) treatment for 6h were assessed in CSCs. Gene expression of CSCs were evaluated based on CD133 selection (MACS), for both drugs. Stemness (NANOG), EMT (MMP2, CXCR4), aassociated gene expression levels were decreased in the CD133⁺ groups of both drugs (p < 0.05). After Temsirolimus treatment, while Vimentin protein level was decreased, E-cadherin protein level was increased (p<0.05) within 3D model. Besides, apoptotic (Bax) and metastatic (Vimentin, ZEB1) protein levels were also decreased significantly after Niclosamide treatment as a result of Western Blot experiments. Additionally, PCR results indicated a significant downregulation of genes such as CXCR4, ABCG1, MMP2, and NANOG following Temsirolimus and Niclosamide treatment in both CD133+, CD133- cell groups. The increase in Bax protein, a key player in apoptosis induction, along with the decrease in the anti-apoptotic protein Bcl-2, suggests the activation of cell death mechanisms. Notably, its targeted impact on the CD44+/CD24- population suggests that these drugs could enhance the sensitivity of CSCs to treatment, preventing tumor recurrence.
Özet (Çeviri)
Heterojen tümör populasyonunda nadir bulunan kanser kök hücreleri (KKH) tümör ilerlemesi ve ikincil tümör oluşumu ile güçlü bir şekilde ilişkilidir. Bu durum, KKH' lerin metastaza nasıl katkıda bulunduğunun açıklığa kavuşturulması ve daha fazla iyileştirme için KKH' lere özgü hedefleme stratejilerinin geliştirilmesi gerekliliğini vurgulamaktadır. İnsan meme kanserini hedef alan yaklaşımlar giderek iyileştirilmiş olsa da, insan meme kanserinde kemik metastazına yönelik etkili tedavi henüz tanımlanmamıştır. Tümör oluşumunu, tümör ilerlemesini ve metastaz süreçlerini aydınlatmak için 3B doku modelleri kullanan yaklaşımlar, in vivo kanser mikroçevresini hedeflemek için kritik öneme sahiptir. Bu tezin temel amacı, TNBC MDA-MB-231 KKH' lerinin, 3B kemik benzeri bir yapıda invazyonundan sonra Temsirolimus ve Niklozamit ile hedeflemenin apoptotik, tümörijenik ve metastatik özellikleri üzerindeki etkisini incelemektir. 0,5 mm katman yüksekliği ve 5 mm çapında uzunlamasına delik içeren PLA filamentli bir 3B yazıcı kullanılarak bir iskele üretilmiştir. Daha sonra, PU silindirik damar benzeri bir yapı iskeleden geçirilmiştir. İskelenin iç kısmı 3,1 mg/mL kolajen-I, 3,6 mg/mL poli-γ-glutamik asit ve 500 µM sodyum metasilikat içeren bir kompozit malzeme ile kaplanmıştır. Kİ-MKH 'ler bu malzeme içine ekilmiştir ve 21 gün boyunca osteogenik olarak farklılaştırılmıştır. Osteojenik farklılaşma 14. ve 21. günlerde Alizarin kırmızı boyama ve kalsiyum kantifikasyonu ile doğrulanmıştır. Kontrol ve osteogenik gruplar arasındaki kalsiyum seviyelerinin benzerliği (p < 0,05), iskelenin kendisinin osteogenik farklılaşmayı indükleyebileceğini göstermektedir. Ek olarak, bu yapı insan göbek kordonu endotel hücreleri (HUVEC'ler) kullanılarak vaskülarizasyonu ve KKH' lerin lokalizasyonunu kolaylaştırarak 3B bir tümör mikroçevresinin taklidini mümkün kılmıştır. KKH' lerde 6 saat boyunca 5 µM Temsirolimus (p-mTOR) ve 100 µM Niklozamit (p-STAT3) etkileri değerlendirilmiştir. Köklülük (NANOG), EMT (MMP2, CXCR4, CDH2), ilişkili gen ifadeleri, her iki ilaç uygulamasının ardından CD133+ hücrelerde azalmıştır (p < 0.05). 3B modelde Temsirolimus uygulaması sonrasında, Vimentin protein seviyesindeki azalmaya karşın, E-kaderin seviyesi artmıştır (p<0.05) Ayrıca, Western Blot deneylerinde Niklozamit uygulaması sonrasında apoptotik (Bax) ve metastatik (Vimentin, ZEB1) protein düzeylerinin de anlamlı şekilde azaldığı ix görülmüştür. Bu çalışma, hem Temsirolimus hem de Niklozamidin, hayatta kalma, kök hücre olma ve direnç yollarını hedefleyerek KKH' lerin metabolizması ve saldırganlığı üzerinde temel bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Apoptoz indüksiyonunda önemli bir rol oynayan Bax proteinindeki artış, anti-apoptotik protein Bcl-2'deki azalmayla birlikte, hücre ölüm mekanizmalarının aktivasyonuna işaret etmektedir. Özellikle, CD44+/CD24- popülasyonu üzerindeki hedefli etkisi, bu ilaçların KKH' lerin tedaviye duyarlılığını artırarak tümör tekrarını önleyebileceğini düşündürmektedir. Meme kanseri, dünya genelinde kadınlarda en yaygın teşhis edilen malignite olup, önemli bir morbidite ve mortalite sebebidir. Hastalığın çeşitliliğini, risk faktörlerini, tanı yollarını ve tedavi stratejilerini anlamak, klinisyenler için hayati öneme sahiptir. Global olarak meme kanseri, tüm kanser teşhislerinin %15' ini oluşturmaktdır. Bu sayının 2035 yılına kadar %2 oranında artması beklenmekte olup, küresel sağlık sistemleri üzerinde artan bir yükü işaret etmektedir (1). Hastalık ağırlıklı olarak kadınları etkilemekte ve vakaların %80'inden fazlası 50 yaş üzerindeki bireylerde teşhis edilmektedir. Ayrıca, artan görülme sıklığı, yaşam tarzı faktörleri, genetik yatkınlık ve yaşlanma ile ilişkilidir. Meme kanseri ile ilişkili risk faktörleri, değiştirilebilir ve değiştirilemez olarak sınıflandırılır. Değiştirilebilir faktörler arasında obezite, hareketsiz yaşam tarzı, alkol tüketimi ve doğum kontrol hapları veya hormon replasman tedavilerindeki ekzojen hormonlara maruz kalma bulunmaktadır. Değiştirilemez faktörler ise yaşlanma, genetik yatkınlıklar (örneğin BRCA1, BRCA2 ve TP53 mutasyonları) ve doğurganlık geçmişi (örneğin, nulliparite veya ileri yaşta gebelik) vb. unsurları içerir. Emzirme ve fiziksel aktivite gibi koruyucu faktörlerin ise riski azalttığı bilinmektedir (2). Tümör oluşumu, esasen hücresel homeostaz mekanizmalarının, özellikle proliferasyon ve apoptozu kontrol eden yolların düzensizliği ile tetiklenir. Bu yollardaki anormallikler, kontrolsüz hücre büyümesine ve sağkalımına yol açarak tümör başlangıcı ve ilerlemesine katkıda bulunur. Östrojen reseptörleri (ER), progesteron reseptörleri (PR) ve insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2) gibi kritik biyobelirteçlerin ifade profili, meme kanserinin moleküler alt tiplerini tanımlamada önemli bir rol oynar. Bu alt tipler, yalnızca prognostik bilgiyi sağlamakla kalmaz, aynı zamanda ER-pozitif tümörler için endokrin x tedaviler veya HER2-pozitif maligniteler için HER2 hedefli ajanlar gibi hedefe yönelik müdahalelere yanıtı öngörerek tedavi stratejilerini yönlendirir (3, 4). KKH' ler, bir tümör içinde kendini yenileme, farklılaşma potansiyeli ve tümör oluşturma kapasitesi gibi kök hücre benzeri özellikler sergileyen ve nadir bulunan bir hücre alt popülasyonunu oluşturur. Bu hücreler, heterojen populasyon içerisinde daha az bulunur, hücre döngüsüne daha nadir girer ve G0/G1 fazında kalırlar. Bunun yanında, kök hücre benzeri özelliklerle karakterize edilirler. Kök hücrelere benzer şekilde, bu hücreler kendi kendini yenileme ve farklılaşma özellikleri gösterir ve nakil sonucu tümör oluşumuna neden olabilirler. CD44, CD133, CD166, EpCAM, CD24 ve ALDH1, akciğer, kolorektal, renal, pankreas, over ve meme kanserlerine ait KKH tanımlamak için sıkça kullanılan hücre yüzey proteinleridir (5). CD44+ ve CD24-/düşük hücre yüzey protein ifade imzasına sahip meme KKH' leri, tümör heterojenitesinde, tedaviye dirençte ve hastalığın tekrarlamasında rol oynayarak meme kanseri tedavisinde önemli zorluklar ortaya çıkarmaktadır (6). Bu hücrelerin konvansiyonel tedavilere rağmen varlıklarını sürdürmesi, klinik sonuçları iyileştirmek için bu hücrelerin hedef alınması gerekliliğini vurgulamaktadır. Genellikle, hızlı bölünen hücreleri hedef alan terapilere karşı daha az hassas olmalarına neden olan uyku (G0/G1) fazında olmaları, proliferatif tümör hücrelerini hedef alan tedavilerden kaçmalarını sağlar (6). Ayrıca, meme tümör popülasyonu içindeki KKH' ler, radyoterapi veya kemoterapötik ajanların neden olduğu genotoksik streslere karşı hayatta kalmalarını sağlayan güçlü DNA hasarı onarım mekanizmaları sergiler. Bu gelişmiş onarım kapasitesi genellikle DNA onarım enzimlerinin aşırı ekspresyonu ile sağlanır (7). ATP bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcılarının, özellikle ABCG2' nin aşırı ifadesi, kemoterapötik ilaçların hücre dışına atılmasına katkıda bulunarak bu ilaçların hücre içi konsantrasyonunu ve etkinliğini azaltır. Bu mekanizma, özellikle meme KKH' erinde belirgin olup çoklu ilaç direnci kazandırır (8). Epitelyal- mezenkimal geçiş (EMT), meme KKH' lerine artan invazyon ve metastaz potansiyeli kazandırır. Bu süreç, apoptoza ve kemoterapötik ajanlara dirençlerini artıran mezenkimal belirteçlerin kazanımını içerir. EMT, meme KKH' lerine artan invazyon ve metastaz potansiyeli kazandırır. Bu süreç, apoptoza ve kemoterapötik ajanlara dirençlerini artıran mezenkimal belirteçlerin xi kazanımını içerir (9). Tümör mikroçevresinin hipoksik koşulları, KKH hayatta kalmasını ve terapötik direnci destekler. Hipoksiye bağlı faktörler (HIF'ler) ve stromal destek gibi faktörler, KKH' leri tedaviden koruyan bir niş oluşturur (10). Meme KKH' lerinin dirençliliğini hedef almak, onların benzersiz hayatta kalma mekanizmalarına yönelik yenilikçi stratejilerin geliştirilmesini gerektirir. Bu doğrultuda umut vadeden yaklaşımlardan biri, KKH' lerin sağkalım ve işlevi için kritik olan anahtar sinyal yollarını bozmayı içerir. Kendini yenileme ve farklılaşma süreçlerini düzenleyen bu yollar arasında Wnt/β-katenin, PI3K/AKT/mTOR, Notch, NF-κB, JAK/STAT3 ve Hedgehog benzeri sinyal yolakları bulunmaktadır (11). Bir diğer strateji, özellikle meme KKH' lerinde yaygın olarak aşırı eksprese edilen ABC taşıyıcılarının neden olduğu direnç mekanizmasını aşmayı hedefler. Bu taşıyıcılar, kemoterapötik ilaçları hücre dışına atarak ilaç etkinliğini azaltır. ABC taşıyıcılarına karşı inhibitörlerin kullanımı, bu mekanizmayı etkisiz hale getirmek ve KKH' lerin kemoterapötiklere duyarlılığını artırmak amacıyla aktif olarak araştırılmaktadır (7). KKH' lerin tümör oluşturucu olmayan hücrelere farklılaşmasını indüklemek, umut vadeden bir diğer terapötik yaklaşımdır. Bu yöntemle, hücreler kök hücre benzeri özelliklerini kaybederek standart kanser tedavilerine karşı daha savunmasız hale gelir. Bu yaklaşım, KKH' lerin tümör oluşturma potansiyelini etkili bir şekilde nötralize etmeyi hedefler. İmmünoterapi de meme KKH' lerini hedef almak için cazip bir strateji olarak öne çıkmıştır. Bağışıklık kontrol noktası inhibitörleri ve kimerik antijen reseptörü (CAR) T-hücre tedavileri gibi teknikler, bu dirençli hücre popülasyonlarının bağışıklık sistemi tarafından tanınmasını ve ortadan kaldırılmasını geliştirmek için geliştirilmektedir. Bu terapiler, vücudun bağışıklık tepkisinden yararlanarak meme KKH' lerini yok etmeyi ve tümörün tekrarlamasını önlemeyi amaçlar. Bu yenilikçi stratejiler bir arada, KKH kaynaklı direncin üstesinden gelme ve meme kanseri hastaları için daha iyi sonuçlar elde etme umudu sunmaktadır (7, 10, 12, 13). Preklinik bulguların klinik ortamda doğrulanması ve KKH' lerin etkili hedeflenmesi için biyobelirteçlerin tanımlanması amacıyla daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Konvansiyonel tedavilerle KKH' ye özgü inhibitörleri birleştiren kombinasyon tedavileri, dirençle başa çıkmada ve meme kanseri hastalarında nüksü önlemede büyük umut vaat etmektedir (14). Bu direnç, xii tümörün hücresel heterojenlik gibi içsel özelliklerine ve çevresindeki mikroçevrenin destekleyici etkisine bağlıdır. Meme kanseri metastaz süreci; invazyon, migrasyon, adhezyon ve tümör hücrelerinin metastatik bölgelerde hayatta kalması gibi bir dizi karmaşık adımdan oluşmaktadır.“Tohum ve toprak”teorisi ilk kez 1889 yılında ortaya atılmıştır. Bu teori, kanser metastazının gelişiminin,“tohumlar”olarak adlandırılan tümör hücreleri ile“toprak”olarak ifade edilen potansiyel metastaz bölgesinin mikroçevresi arasındaki etkileşimlere bağlı olduğunu öne sürmektedir (15, 16). Meme kanseri metastazının gelişim sürecinde, primer tümör bölgesindeki kanser hücreleri, büyümelerini sürdürmek için ihtiyaç duydukları besinlere erişimi sağlamak amacıyla öncelikle anjiyogenezi indükler. Bu süreçte, tümör hücreleri vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) gibi anjiyogenezde kilit rol oynayan büyüme faktörlerini yüksek oranda ifade eder. Bu faktörlerin etkisiyle oluşan yeni kan damarları, tümör hücrelerinin kan ve lenfatik damarlara giriş yapması için bir yol oluşturur (17). Normal epitel dokusu hücrelerinde olduğu gibi, meme kanseri hücreleri arasında da E-kaderin gibi hücre hücre bağlantılarını sağlayan proteinler aracılığıyla sıkı hücresel bağlantılar bulunur. Ancak, bu sıkı bağlantılar hücre hareketi ve invazyonu açısından bir engel teşkil eder. Bu nedenle, meme kanseri hücreleri, EMT sıraasında epitel fenotiplerini kısmen kaybeder ve mezenkimal özellikler kazanır. EMT sürecinde E-kaderin seviyeleri azalırken, N-kaderin, vimentin ve fibronektin gibi mezenkimal belirteçler yüksek oranda ifade edilir. Bu dönüşüm, hücrelerin hareketliliğini artırarak invazyon kapasitelerini destekler (18). EMT'nin ardından, primer tümör bölgesinde bulunan meme kanseri hücreleri, ekstrasellüler matriksin parçalanması için kritik öneme sahip olan matriks metalloproteinazlar (MMP'ler) sınıfını salgılamayı teşvik eder. MMP-2 ve MMP-9, özellikle bazal membranın parçalanmasında rol oynayan en önemli enzimler arasında yer alır. MMP'lerin etkisiyle tümör hücreleri bazal membranı aşarak ekstrasellüler matrikse ve çevredeki normal dokulara nüfuz eder (19). İnvazyonun ardından tümör hücreleri kan dolaşımına girerek sirküle tümör hücreleri haline gelir ve kan damarları veya lenfatik damarlar yoluyla kemiğe yayılır. Bu hücreler, dolaşımda tek hücreler olarak ya da çok hücreli kümeler şeklinde xiii taşınabilir. Çok hücreli kümeler, dolaşım sisteminde küçük çaplı kapillerle karşılaşana kadar hayatta kalabilir. Bu sirküle hücrelerin çoğu hızla elimine edilirken, kümeler, yapışkan etkileşimlerini koruyarak mikro damarlardan geçip tek hücre zincirleri oluşturabilir (20). Bu hücreler ler kemiğe ulaştığında, vasküler bazal membranı parçalayarak ve kan damarlarına nüfuz ederek parankimal dokuya giriş yapar. Kemik mikroçevresine adapte olabilmek için biyolojik fenotiplerini değiştirir ve yayılmış tümör hücreleri haline gelerek doku parankimasında uzun süre hayatta kalabilir. Anoikis adı verilen hücre ölümüne karşı direnç mekanizmaları geliştirerek yaşamlarını sürdürebilirler. Kemik mikroçevresi aynı zamanda çeşitli sitokin ve kemokinlerin ekspresyonunu indükleyerek meme kanseri hücrelerinin kemiğe yönelmesini teşvik eder ve primer kanser hücrelerini daha fazla çekebilir. C-X-C motif kemokin reseptörü tip 4 (CXCR4) ve onun ligandı CXCL12, ayrıca NF-κB reseptör aktivatörü (RANK) ve RANK ligandı (RANKL) gibi moleküllerin, meme kanseri hücrelerinin kemiğe yönelmesinde büyük öneme sahip olduğu kanıtlanmıştır (21). Bunun yanında, RANKL/ RANK/ osteoprotegerin (OPG) sistemi, kemik oluşumu ve rezorpsiyonunun düzenlenmesinde kritik bir rol oynar. RANKL'nin, doğrudan RANK eksprese eden hücreleri kemiğe yönlendirerek kemik metastazını indükleyebildiği kanıtlanmıştır (22). Yayılmış tümör hücreleri, kemik metastazı için genellikle kemik iliği gibi uygun metastatik mikroçevreye yapışır. Bu süreç, temel olarak integrinler ve kaderinler tarafından düzenlenir. Integrinler, heterodimerik bir transmembran glikoprotein ailesine ait proteinlerdir ve meme kanseri hücrelerinin ekstraselüler matrikse yapışmasını sağlar (22). E-kaderin, hücre-hücre yapışmasını sağlayan epitelyal spesifik birtransmembran glikoproteindir ve normal hücrelerde hücresel polariteyi ve epitelyal morfolojiyi korur. Bu molekülün kaybı, tümör hücrelerinin göç ve invazyon yeteneklerini artırabilir. Ayrıca, E-kaderin ve N-kaderin, meme kanseri hücreleri ile kemik iliği stromal hücreleri arasındaki etkileşimi düzenleyerek kanser hücrelerinin kemik iliğine yönelmesini destekler (23). Kemik mikroçevresi, çeşitli mekanizmalar yoluyla ilaç direncine katkıda bulunur. Bunlar arasında, kemoterapötik ajanlardan kanser hücrelerini koruyan sinyal yollarının aktivasyonu, hücresel dormansiyi teşvik etme ve metastatik bölgelerde xiv ilaçların biyoyararlanımını azaltma yer alır. Kemik dokusunun bu benzersiz özellikleri, metastatik meme kanserinde tedavi direncinin gelişiminde kritik faktörler olarak giderek daha fazla tanınmaktadır (24). Bu tez çalışmasında, kolajen-I/poli-gama glutamik asit (γ-PGA) ve sodyum metasilikat (Na₂SiO₃) içeren bir kompozit malzeme kullanılarak kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin (Kİ-MKH) osteojenik farklılaşmasını destekleyen in vitro bir kemik benzeri yapı oluşturulmuştur. Kolajen, biyouyumluluğu ve ekstraselüler matrikse olan benzerliği nedeniyle kemik doku mühendisliği için umut verici bir malzeme olarak öne çıkmaktadır. Ancak, doğal olarak düşük mekanik dayanımı, mekanik strese maruz kalan veya sağlam yapısal destek gerektiren uygulamalardaki kullanımını sınırlamaktadır. Bu sınırlamayı aşmak için, kolajen genellikle nanometre ölçeğinde silika ile birleştirilerek kemik doku mühendisliği için önemli potansiyele sahip kompozit malzemeler oluşturulabilir. Son 15 yılda, silika-kolajen kompozitlerinin geliştirilmesine yönelik önemli araştırmalar yapılmıştır. Bu kompozitler, organik matriks olarak hizmet eden kolajene çeşitli biyoaktif inorganik malzemelerden elde edilen silikanın dahil edilmesiyle oluşturulur (25, 26). Önceki çalışmalar, diyetle alınan silisyum (Si) ile kemik sağlığı, özellikle de kemik mineral yoğunluğu arasında olumlu bir ilişki olduğunu ortaya koymuştur. Ancak, kemik oluşumuna yönelik hücresel düzeydeki etkileri henüz netlik kazanmamıştır. Kim ve arkadaşları, MC3T3-E1 hücrelerinde 0 ile 100 μM arasında değişen konsantrasyonlarda Na₂SiO₃ kullanarak osteoblast aktivitesi ve kemik mineralizasyonundaki rolünü araştırmıştır. Sonuçlar, 5 ve 10 μM Na₂SiO₃hücre içi alkalen fosfataz (ALP) aktivitesini önemli ölçüde artırdığını, mineralize nodül oluşumunu geliştirdiğini ve 50 μM Na₂SiO₃'ün 7 ve 14 günlük takviye süresince kolajen-I ifadesini anlamlı şekilde up regüle ettiğini göstermiştir (p < 0.05) (27).Bir başka yakın tarihli çalışmada, 100 ve 200 ng/mL Na₂SiO₃ ile kombine edilen MKH yapılarının, daha düşük konsantrasyonlara (0 ve 10 ng/mL) kıyasla, kıkırdak kalınlığı, alanı ve mekanik dayanımını anlamlı şekilde geliştirdiği saptanmıştır. Özellikle, 200 ng/mL grubu, en yüksek mekanik ve biyokimyasal ulaşmış ve bu konsantrasyonun kondrojenik farklılaşmayı teşvik etmek için optimum seviye olduğunu göstermiştir. Bu bulgular, MKH temelli kemik ve kıkırdak modellerinde hem yapısal hem de fonksiyonel özellikleri geliştirerek Na₂SiO₃ xv varlığının kemik/ kıkırdak gelişimini artırma potansiyelini vurgulamaktadır (28). Kompozit malzememizin bir diğer bileşeni olan poli gama-glutamik asit (γ-PGA), doğal olarak elde edilen, biyolojik olarak parçalanabilir bir polimer olup mükemmel biyouyumluluk ve su tutma özelliklerine sahiptir. Bu özellikler, iskelelerin hücrelerle uzun süreli etkileşim kurmasını ve nemli kalmasını sağlar. Kolajen, hücre dışı matrikste temel yapısal protein olduğundan kemik rejenerasyonunda sıkça kullanılır. Ancak mekanik dayanımı sınırlılığından dolayı kullandığımız γ-PGA' nın, kolajenin yapısal matriksini güçlendirerek iskeletin fizyolojik koşullarda daha dayanıklı olmasını sağladığı bildirilmiştir (29). Güncel bir çalışmada (2022), 3B baskı tekniği kullanılarak, kemik yapısını taklit eden katmanlı bir iskelet oluşturulmuştur. İlk katman, hidroksiapatit (650 mg/ml) ve γ-PGA (200 mg/ml) içerirken, sonraki katmanlar 45 mg/ml kolajen-I ve 2 mg/ml γ-PGA ile hazırlanmıştır (29). Oluşturulan iskele üzerine sıçan Kİ-MKH' leri ve insan yağ dokusundan elde edilen kök hücreler eklenmiştir. Hücrelerin iskele üzerinde tutunduğu, çoğaldığı ve osteojenik olarak farklılaştığı gözlemlenmiştir. Kompozit iskelelerin mekanik dayanıklılığı, çekme ve eğilme tesleri ile değerlendirilerek, iskelelerin dayanımlı ve güçlü biyomekanik özellikler sunduğu gösterilmiştir. Ek olarak, aynı çalışmada, iskele üzerine ekrilen hücrelerin bağlanma, çoğalma ve osteojenik farklılaşma yetenekleri gözlemlenmiştir. ALP aktivitesi, mineralizasyon ve Kolajen tip I alfa 1 (COL1A1) ekspresyonu artışı ile iskelelerin osteojenik süreçleri teşvik ettiğini ve kemik oluşumuna uygun bir ortam sunduğunu gösterilmiştir. Son olarak, in vivo testlerde fareler üzerine implantasyon yapılmıştır. Farelerin kemik rejenerasyonu gösteren bölgeleri, histolojik analizlerle incelenmiş ve sonuçlar, kompozit iskelelerin kemik iyileşmesine önemli katkı sağladığını göstermiştir. Bu tür analizler, iskelelerin osteojenik özelliklerini doğrulamak için kullanılmıştır. Bir diğer çalışmada ise, hazırlanan kolajen-I/ γ-PGA hidrojelinin, oda sıcaklığında düşük viskoziteye sahip olup, vücut sıcaklığında yüksek elastik modül ve viskoz modüle dönüşmesinden faydalanılmıştır. Bu özellik, hidrojelin kolayca enjekte edilmesini ve sonra vücut sıcaklığında mekanik destek sağlamaktadır (30). Çalışmada, kemik oluşumunu artırmak amacıyla, kemik morfogenetik protein-2 (BMP-2) eklenmiş MKH' ler ile hidrojele osteojenik özellik kazandırılmıştır. Alizarın kırmızı boyama testi ile xvi kalsiyum birikintileri gözlemlenmiş ve osteojenik belirteçlerin ifadesi, ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) ile değerlendirilmiştir. Ayrıca, fare calvarial kemik defekti modelinde kemik rejenerasyonu test edilmiştir. Mikrotomografi (micro-CT) ve histolojik analizler ile yeni kemik oluşumu izlenmiştir. In vitro çalışmalarda, Kolajen-I/ γ-PGA hidrojelinin BMP-2 ile kombinasyonu, osteojenik gen ekspresyonunu önemli ölçüde artırmıştır. In vivo çalışmalarda ise bu iskele, kritik boyutta kemik defekti olan farelerde 3-4 hafta içinde önemli derecede kemik oluşumu sağlamıştır. Bu bulgular, hidrojel sisteminin BMP-2 ve MHK' lerle birlikte osteogenezi teşvik etme ve kemik dokusu rejenerasyonunu desteklemede yüksek etkinlik gösterdiğini ortaya koymaktadır (30). Devam eden araştırmalara rağmen, direnç mekanizmalarının çoğu hâlâ yeterince anlaşılamamıştır. Bu bilgi eksikliğini gidermek amacıyla birçok araştırmacı, tümör hücreleri ile kemik mikroçevresi arasındaki etkileşimi incelemek için ileri düzey in vitro modeller kullanmaktadır. Bu modeller, metastaz ve ilaç direncinin biyolojik dinamiklerine dair değerli bilgiler sunmaktadır (31). Son yıllarda, kanser tedavisinde ilaç yeniden kullanımı yaklaşımının benimsenmesine olan ilgi artmıştır. İlaç yeniden kullanımı, mevcut ilaçların yeni kullanımlarını bulma sürecini ifade eder. Bu tez kapsamında bu amaçla uygulanan Niklozamidin hidrofobik doğası nedeniyle sistemik dağılımı sınırlıdır, ancak nanokapsül taşıyıcıları ile tümörlere hedeflenmiş taşıma sağlanabilmektedir. Bu ilaç, STAT3'ün onkojenik sinyal yolaklarındaki önemi nedeniyle, klinik olarak onaylanmış bir dizi ilaç, kanser tedavisi için yeniden kullanılmak amacıyla STAT3 inhibitörü olarak incelenmiştir (32). Niklozamit, 1982 yılında ABD Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) onaylı bir antihelmintik ilaçtır. Niklozamit, oksidatif fosforilasyonu inhibe ederek ve tenya parazitlerinin mitokondrisindeki ATPaz aktivitesini uyararak çalışır. Niklozamit, aynı zamanda bir dizi hücre içi sinyal yolakları üzerinde (örneğin, Wnt/β katenin, mTORC1, NF-κB ve Notch) etkiler gösterdiği gibi, STAT3'ün aktivasyonunu, nükleer translokasyonunu ve transaktivasyonunu güçlü bir şekilde inhibe ettiği bildirilmiştir (32, 33). Bugüne kadar yapılan birçok çalışma, Niklozamidin kolorektal kanser tedavisindeki terapötik etkinliğini kanıtlamıştır (34-36). Bu tez kapsamında uyguladığımız bir diğer ajan olan Temsirolimus, memeli rapamisin hedefi (mTOR) xvii inhibitörüdür. Temsirolimus, TNF reseptör 1'e yanıt olarak nekrozom oluşumunun başlatılması ve RIPK1-RIPK3-MLKL sinyal yolu aktivasyonu için gerekli olan FKBP-12 proteinine bağlanır. Oluşan bu protein-ilaç kompleksi, hücrenin kendini yenilenmesi ve mitotik aktivitesini düzenleyen mTOR yolağının inhibisyonu ile sonuçlanarak kanser hücrelerinin G1 fazında tutuklanmasına yol açar. mTOR inhibe edildiğinde, mTOR'un p70S6k ve S6 ribozomal protein gibi alt hedeflerini fosforile etme yeteneği engellenir; bu proteinler, PI3 kinaz/AKT yolaklarının aşağı akışında yer alır. mTOR kompleksi, mTORC1 ve mTORC2 olarak iki ana bileşene ayrılır. Temsirolimus, mTORC1'i inhibe ederek S6 kinaz ve 4EBP1 gibi hedeflerin fosforilasyonunu inhibe eder. Dolayısıyla, hücre büyümesinin durmasına ve protein sentezinin engellenmesine yol açar. Ayrıca, anjiyogenezi ve tümör hücre proliferasyonunu azaltır, çünkü mTORC1, hücre metabolizmasını ve HIF-1α'nın stabilizasyonunu da tetiklediği bilinmektedir (37, 38). Bu tez çalışmasının hipotezleri: Hipotez 1: Kollajen tip I / Poli-gama-Glutamik asit (PGA) ve sodyum metasilikat ile 3B kemik benzeri yapı ortaya konulabilir. Objektif 1: Malzeme performansının (viskozite,gerinim, SEM) ve MKH' lerin 21 günlük osteojenik farklılaşmanın değerlendirilmesi (WST-1, Alizarin Red boyaması, kalsiyum birikimi, RT-qPCR) Hipotez 2: 3B yapı damarlandırılarak meme KKH' lerinin invazyonu modellenebilir. Objektif 2: 3B modelin 3B yazıcı ve elektroeğirme yöntemi ile hazırlanması, yapının optimize edilen kompozit malzeme ile desteklenmesi, HUVEC ile damarlandırmanın sağlanması, KKH izolasyonu ve takibi Hipotez 3: 3B modelde Temsirolimus uygulaması sonrasında KKH' lerde mTOR yolağı/ köklülük/ilaç direnci baskılanabilir. Objektif 3: Western Blot ile p-mTOR, mTOR, p-AKT, AKT, p70S6KB1, p-p70S6KB1, Vimentin, E-kaderin protein seviyelerinin değerlendirilmesi xviii RT-qPCR ile invazyon ve metastaz ilişkili CXCR4, MMP2, MMP9 gen ifadelerinin, OCT3/4, NANOG pluripotensi genlerinin ve CDH1 ve CDH2 gen ifadelerinin değerlendirilmesi Hipotez 4: 3B modelde Niklozamit uygulaması sonrasında KKH' lerinde Wnt/ß katenin yolağı/ köklülük/ilaç direnci baskılanabilir. Objektif 4: Western Blot ile Vimentin, C-Myc, EpCAM, ALDH1A1, Bax, Bcl-2, ZEB1, p-GSK3ß protein seviyelerinin değerlendirilmesi RT-qPCR ile invazyon ve metastaz ilişkili CXCR4, MMP2, MMP9 gen ifadelerinin, OCT3/4, NANOG pluripotensin genlerinin, CCND1, ABCG1 ve ABCG2 gen ifadelerinin ve Wnt hedef genleri olan AXIN2 ve LGR5 ifadelerinin değerlendirilmesi Agresif doğası ve sınırlı hedefe yönelik tedavi seçenekleri nedeniyle kötü prognozlarla ilişkilendirilen üçlü-negatif meme kanseri hücre hattı MDA-MB-231, yüksek tedavi direnci ve metastaz eğilimleri ile bilinmektedir, bu durum tedavinin ardından olumlu yanıt almayı zorlaştırmaktadır. Araştırmamız, tümör hücrelerinin kendini yenileyebilme ve farklılaşabilme yeteneğine sahip olan, geleneksel tedavilere karşı direnç gösteren, metastaz yapma özelliğindeki KKH' lerin, 3B bir kemik benzeri yapı içerisinde uygulanan ilaçlar (Temsirolimus/Niklozamit) ile, apoptotik, metastatik, köklülük, ve onkojenik özelliklerinin değerlendirilmesini hedeflemektedir. Bu çalışmada, CD73 (%98,7), CD90 (%99,3) ve CD105 (%98,2) pozitifliği akım sitometri ile tespit edilen insan Kİ-MKH' leri, kompozit malzeme içinde osteojenik yönde farklılaştırılmak üzere karakterize edilmiştir. Bu kapsamda kolajen-I/γ PGA/Na2SiO3 kompozit malzeme ile oluşturulan 3B kemik taklidi yapının elde edilmesi, bu üçlü kompozisyonun bir araya getirilmesi açısından orijinallik taşımaktadır. Hazırlanan malzemenin mikro mimarisi ve porozitesi SEM ile görselleştirilmiş, reolojik özellikleri analiz edilmiştir. MKH' lerin canlılığı ve proliferasyonunun, 7, 14 ve 21 günlük kültür süresi boyunca göre %80'in üzerinde olduğu WST-1 ile tespit edilmiştir. Dolayısıyla kompozit malzemenin, Kİ-MKH'lerin canlılığını ve proliferasyonu desteklediği ve toksik etki gostermediği ortaya konmuştur. Ardından, literatürden xix esas alınarak hesaplanan (30) ve ön çalışmalar ile belirlenen kolajen-I: 3.1 mg/mL, PGA: 3.6 mg/mL ve Na₂SiO₃: 500 µM içeren solüsyonun jelleşmesi sağlanarak viskozite ve kayma gerinimleri, mekanik strese dayanıklıkları ortaya konmuştur. Bu sebeple literature göre optimize ederek belirlemiş olduğumuz hidrojel bileşeni ile deneylere devam edilmiştir. Osteojenik farklılaşma, 14. ve 21. günlerde Alizarin kırmızı boyaması ve kalsiyum miktarının ölçümü ile doğrulanmıştır. Hem kontrol hem de osteojenik ortamda kültüre edilen hücre gruplarındaki kalsiyum seviyelerinde belirgin fark bulunmamıştır (p<0.05). Bu bulgu, oluşturulan iskelenin kendi başına osteojenik farklılaşmayı indükleyebildiğini göstermektedir. Ayrıca, bu yapının insan göbek kordon veni endotel hücreleri (HUVEC' ler) ile damarlandırılmasının sağlanması ve MDA-MB 231 KKH' lerinin yapıya lokalizasyonunun sağlanması, 3B tümör mikroçevresi taklidine olanak sağlamıştır. Bunun için, MDA-MB-231 hücre hattından MACS yöntemi ile ayrıştırılan KKH hücrelerinde yüzey belirteçleri tayin edilmiş ve CD44+ (%99.85) ve CD24-/düşük (%0.15) ifade profilinde oldukları doğrulanmıştır. Ardından, 5 gün boyunca kültürde tutularak, tümör sferoidi oluşturulmuş ve morfolojileri değerlendirilmiştir. 6 saat (6sa) Temsirolimus uygulamasının ardından Western Blot sonuçlarımız, 5 µM Temsirolimus uygulamasının ardından p-mTOR protein seviyelerinde azalma olduğunu göstermiş (p<0.05) ve hedeflenen sinyal yolundaki etkisini desteklemiştir. Benzer şekilde, Annexin-V/7AAD boyaması sonucunda 100 µM Niklozamit uygulamasının, IC50 dozu olarak MDA-MB-231 KKH' lerinde etkinliği belirlenmiştir. Ek olarak, Niklozamit uygulaması, hücre hayatta kalma, proliferasyon ve köklülük özellikleri ile ilişkili kritik bir transkripsiyon faktörü olan p-STAT3 protein seviyelerini azaltırken (p<0.05), pro-apoptotik bir protein olan Bax seviyelerini artırmıştır (p<0.05). Aynı zamanda anti-apoptotik bir protein olan Bcl-2 seviyelerinde azalma gözlenmiştir; bu durum, apoptotik sinyalizasyonun güçlendiğini ve hücrelerin terapötik ajanlara daha duyarlı hale geldiğini ortaya koymaktadır. STAT3, KKH' lerde köklülük özelliklerini korumada önemli bir rol oynar ve metastazı teşvik eden bir sinyal yoludur (39). Bax'ın artışı ise mitokondriyal apoptoz mekanizmasının aktive edildiğini göstermektedir ve KKH' lerde genellikle tümör hayatta kalmasını artırmak için xx baskılanan bir süreç olarak tanımlanmaktadır (40). Ön çalışmalar ile, Annexin V-7AAD ve Western Blot analizi sonuçları doğrultusunda 5 µM Temsirolimus ve 100 µM Niklozamit dozları uygulama süresince (6sa) KKH'ler için IC50 değeri olarak belirlenmiştir. Çalışmamızda Temsirolimusun (IC50 5 µM, 6sa) KKH'lerde apoptozu indüklediği ve p-mTOR seviyelerini azalttığı saptanmıştır. Bu bulgu, KKH metabolizmasını, proliferasyonunu ve hayatta kalmasını düzenleyen mTOR sinyal yolunun etkili bir şekilde bozulduğunu göstermektedir (41). Ayrıca, Temsirolimus uygulamasını takiben EMT ilişkili Vimentin protein seviyesinin azalmasından yola çıkarak Temsirolimusun, KKH'nin yayılmacı ve metastatik potansiyelini azalttığını düşündürmektedir. Ancak, ZEB1 seviyesinde anlamlı bir değişiklik gözlemlenmemiştir, bu da anti-EMT etkilerinin kapsamlı incelenmesi gerekliliğini düşündürmektedir. RT qPCR ile gen ifadelerini değerlendirmek amacı ile 3B modelde ilaç ile hedeflenen hücrelerde, dirençli CD133+ ve CD133- hücrelerin izole edilmesi amacı ile MACS metodu uygulanmıştır. RT-qPCR sonuçlarımız, Temsirolimus ve Niklozamitin hem CD133+ hem de CD133- hücrelerde metastaz, ilaç direnci ve köklülükle ilişkili gen ifadelerini etkili bir şekilde azalttığını göstermektedir. Önemli bulgular arasında KKH' lerde CXCR4, MMP2 ve MMP9 gen ifadelerindeki azalma yer almaktadır. Bu genler, metastaz ve ECM parçalanması için kritik öneme sahiptir. Bu gen ifadelerinin azalması, Temsirolimusun, KKH' lerin göç ve invazyon kapasitesini engellediğini düşündürmektedir (42). Temsirolimus ve Niklozamit uygulamaları sonrasında ABCG1 mRNA seviyeleri azalırken, ABCG2 seviyelerinde hem CD133+ populasyonda Temsirolimus hem de CD133 ayrımı öncesinde Niklozamit uygulanmış hücre gruplarında artış gözlemlenmiştir. Bu durum, tedaviye rağmen bazı çoklu ilaç direnci mekanizmalarının devam edebileceğini göstermektedir (43). CD133+ hücrelerde ve tüm gruplarda CDH1 ekspresyonunda artış gözlemlenmiştir ve bu durum EMT baskılanmasını ve epitel özelliklerin güçlendiğini düşündürmektedir. Genel olarak, Temsirolimus, özellikle daha kök hücre benzeri ve tedaviye dirençli CD133+ popülasyonlarında, invazyon ve metastaz için kritik yolları öncelikli olarak hedef alırken ilaç direnci mekanizmalarını kısmen baskılamıştır. 3B modelde Niklozamit xxi uygulaması, metastaz ve hücre göçü ile ilişkili genlerin (MMP2, MMP9) ekspresyonunu anlamlı derecede baskılamıştır (p<0.05). CXCR4, özellikle kemik metastazında önemli bir rol oynayan ve kanser hücrelerinin kemotaktik göçünü yönlendiren bir kemokin reseptörüdür. CXCL12 ligandının kemik mikroçevresindeki yüksek varlığı, metastatik göçü destekler (44). MMP2 ve MMP9 matriks metalloproteinazları, hücre dışı matriksin yıkımını sağlayarak tümör invazyonunu ve metastazı kolaylaştırmaktadır. Bu gen ifadelerinin baskılanması, Niklozamidin metastatik sinyalizasyon yollarını etkili bir şekilde bozduğunu göstermektedir (45). İlaç direnciyle ilişkili genlerin ekspresyonunda anlamlı azalma saptanmıştır (p<0.05). Bu genler, kemoterapötik ajanların hücre dışına atılımını sağlayarak KKH' lerin tedaviye direnç geliştirmesinde kritik rol oynar (46). Niklozamidin bu genlerin baskılanmasını sağlaması, KKH'lerin geleneksel tedavilere duyarlılığını artırabileceğini göstermektedir. Yüksek invazyon ve metastaz potansiyeline sahip olan oral skuamöz hücreli karsinomda, OCT3/4, NANOG ve SOX2 vb. köklülük belirteçlerinin artan ifadesi ve sferoid oluşumu ile karakterize edilen KKH' lerde Niklozamidin etkileri araştırılmıştır. Bu çalışmada, Niklozamit, Wnt/β-katenin sinyal yolunu hedef alarak β katenin, DVL2, fosforile GSK3β ve Siklin D1 (CCND1) ekspresyonunu azaltığı gösterilmiştir. Bu inhibisyon, tümör sferoid oluşumunu ve köklülük belirteçleri olan OCT4 ve NANOG' un ekspresyonunu anlamlı derecede baskılamıştır (p<0.05). Ayrıca, EMT süreçlerini engelleyerek vimentin, SNAIL, MMP2 ve MMP9 gibi metastazı destekleyen genlerin ekspresyonunu azaltmış; E-kaderin ve TIMP2 düzeylerini artırmıştır. Bu yönüyle çalışma, araştırmamıza benzer bulgular taşımaktadır. Niklozamit, aynı zamanda sisplatin ile zenginleşen dirençli KKH' leri de inhibe ederek hücrelerin sisplatine karşı duyarlılığını artırmıştır. Bulgular, Niklozamidin pek çok kanser türünün tedavisinde, özellikle kemoterapi direnci ve metastazı hedef alan bir ajan olarak önemli bir potansiyele sahip olduğunu göstermektedir (47). Niklozamidin Wnt/β-katenin, STAT3 ve NF-κB yollarını inhibe etme yeteneği, onu KKH'lere karşı güçlü bir ajan olarak konumlandırmaktadır. Bulgularımız, Niklozamit ve Temsirolimusun EMT ilişkili genlerin ekspresyonunu azalttığını ortaya koymuştur. Temsirolimus, KKH metabolizması ve konvansiyonel tedavilere dirençte xxii kritik olan mTOR aracılı sinyalleri bozmuştur. Benzer şekilde, Niklozamit, STAT3 ve Wnt/ß-katenin dahil olmak üzere birden fazla hayatta kalma yolunu inhibe ederek KKH direncini azaltmıştır. ABCG1 ve ABCG2 gibi ABC taşıyıcılarının ekspresyonunun azalması, bu ilaçların çoklu ilaç direnci mekanizmalarını hedeflemedeki etkinliğini desteklemektedir. Dolayısıyla bulgularımız, Temsirolimus ve Niklozamidin köklülük, EMT ve çoklu ilaç direnciyle ilişkili yolları hedeflemede etkinliğini vurgulamakta ve özellikle daha dirençli olan CD133+ hücrelerde önemli bir etki gösterdiğini ortaya koymaktadır (48). Sonuç olarak, bu çalışma, Temsirolimus ve Niklozamidin KKH canlılığını etkili bir şekilde azalttığını, köklülükle ilişkili belirteçleri baskıladığını ve önemli ilaç direnci mekanizmalarının üstesinden geldiğini göstermiştir. Bu sonuçlar, bu ajanları TNBC gibi agresif meme kanseri alt tipleri için hedefe yönelik terapilerde umut verici adaylar olabileceğini düşündürmektedir.
Benzer Tezler
- B2O3-CaO-Na2O-SiO2 dörtlü sistemini oluşturan üçlü denge diyagramlarında katı hal faz bağıntıları
Başlık çevirisi yok
YILMAZ TAPTIK
- Marketing strategies of international firms operating in household cleaning materials sector in Turkey
Başlık çevirisi yok
ERKİN ERİMEZ
- Asetaminofenin koaservasyon-faz ayrışması yöntemiyle mikrokapsüllerinin hazırlanması
Başlık çevirisi yok
AYŞEGÜL KARATAŞ
Yüksek Lisans
Türkçe
1989
Eczacılık ve FarmakolojiAnkara ÜniversitesiFarmasötik Teknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. TAMER BAYKARA
- Siklofosfamid mikrokürelerinin formülasyonu ve in vitro-in vivo yararlanımı üzerinde çalışmalar
Başlık çevirisi yok
İMRAN VURAL
Yüksek Lisans
Türkçe
1989
Eczacılık ve FarmakolojiHacettepe ÜniversitesiFarmasötik Teknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. SÜHEYLA KAŞ
- JIT (tam zamanında) üretim sistemi yaklaşımı ve bir uygulama önerisi
Başlık çevirisi yok
AYFER DOYURAN
Yüksek Lisans
Türkçe
1990
Endüstri ve Endüstri MühendisliğiAnadolu ÜniversitesiY.DOÇ.DR. NİHAT YÜZÜGÜLLÜ
