Geri Dön

Addressing the impact of sphingoid base chain length on cell signaling and function

Sfingoid baz zincir uzunluğunun hücre sinyalizasyonu ve işlevi üzerindeki etkisi

  1. Tez No: 936941
  2. Yazar: AYSU BAŞAK KÖK
  3. Danışmanlar: DR. ROGER SANDHOFF
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoloji, Genetik, Nöroloji, Biology, Genetics, Neurology
  6. Anahtar Kelimeler: Lipid metabolizması, Sfingolipidler, Lipid metabolism, Sphingolipids
  7. Yıl: 2024
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Ruprecht-Karls-Unıversıtat-Heıdelberg
  10. Enstitü: Yurtdışı Enstitü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyolojik Bilimler Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

Sfingolipidler, hücresel zarların temel lipid bileşenleridir ve karmaşık metabolik yolları, amino asit, yağ asidi, fosfogliserolipid ve karbonhidrat metabolizması ile birbirine bağlanır. Hücresel zarların yapısını etkiler, sinyal iletim kaskadlarına katılır ve hücreler arası iletişimi düzenlerler. Bu nedenle, proliferasyon, apoptoz ve hücresel farklılaşma gibi birçok hücresel sürecin düzenlenmesine katkıda bulunurlar. Sfingolipidlerin çekirdeği, serin palmitoiltransferaz (SPT) enziminin etkisiyle sentezlenen, uzun zincirli bir amino-alkol olan sfingoid bazdan oluşur. SPT, 3 polipeptitten oluşan bir komplekstir ve sfingolipid biyosentezinin hız sınırlayıcı adımını katalize eder. Bu nedenle, SPT aktivitesi, örneğin ORMDL peptitlerinin inhibisyonu ve endoplazmik retikulum zarındaki seramid konsantrasyonları yoluyla geri bildirim düzenlemesi ile kontrol edilir. Buna karşılık, SPT kompleksinin küçük alt birimi (SPTSSA veya SPTSSB) enzimin aktivitesini artırır ve son sfingoid bazların zincir uzunluğunu belirler. Seramidlerdeki sfingoid bazların uzunluğunun, özellikle mikrobölge oluşumu için faz ayrımını teşvik edebilecek şekilde, zarların düzenini ve akışkanlığını etkileyerek çift tabakanın özellikleri üzerinde bir etkisi olduğu gösterilmiştir. Mikrobölgeler, proteinleri seçici olarak toplayarak veya dışlayarak ve etkileşim ortakları arasındaki etkileşimi kolaylaştırarak hücre sinyalleşmesi için bir merkez görevi gördüğünden, sinyal yollarını ve ilgili sinyal olaylarını modüle etmek için gereklidir. Seramidlerdeki sfingoid baz uzunluğunun, mikrobölge oluşumunu ve seramid açısından zengin jel fazı içindeki moleküller arası etkileşimleri başlatmada asit zincirinin uzunluğuna kıyasla daha büyük bir etkisi olduğu gösterilmiştir. Daha uzun sfingoid bazlar, mikrobölgelerin kararlılığını artırma eğiliminde olduğundan, bu durum ilgili sinyal olaylarının süresini ve şiddetini etkileyebilir. Şu ana kadar, bu konu yeterince araştırılmamış olup, 18 karbonu aşan karbon zincirine sahip sfingoid bazların fizyolojik roller ve biyolojik önemi belirsizliğini korumaktadır. Bu boşluğu doldurmak için, CRISPR-Cas9 ile düzenlenmiş SPTSSA knock out (KO) monoklonal nöroblastoma hücreleri (SH-SY5Y) başarıyla ürettim. SPTSSA KO, SPT aktivitesinde azalmaya ve diğer hücresel sistemlerdeki son raporlarla uyumlu olarak, ilgili kontrol hücre klonlarına kıyasla C20-sfingozin içeren seramid miktarında 7 katın üzerinde bir artışa neden oldu. Ancak, toplam seramidlerin sabit durum seviyeleri önemli ölçüde etkilenmedi. C18-sfingozin içeren seramidlere kıyasla, C20-sfingozin içeren seramidlerde C22 ve C24 asit zincirleri zenginleşirken, C16 asit zincirleri belirgin şekilde azaldı. Bu seramid bileşimindeki kaymanın hücre homeostazı ve fonksiyonları üzerindeki etkisini incelemek için, SPTSSA KO hücrelerindeki hücresel değişiklikleri hem sabit durumda hem de nöron benzeri hücrelere farklılaşma indüksiyonu üzerine izledim. Çoklu omik çalışmaları ile, seramid türlerinin dağılımındaki değişikliklerin hücredeki küçük bir proteom, fosfo-proteom ve lipidom alt kümesini değiştirdiğini ortaya çıkardım. En belirgin değişiklikler, çözünebilir metabolitlerin konsantrasyonlarında gözlemlendi. SPTSSA KO klonlarının oluşturulmasından sonra ve 30'dan fazla pasajdan sonra proteomu karşılaştırıldığında, KO ve kontrol grupları arasında kalıcı farklı ekspresyon gösteren birkaç protein (AHNAK, SLC27A6, MVP, CNTNAP1 SH3PXD2A) bulundu. Ancak, hücre döngüsü ve proliferasyon ile ilişkili bu proteinler zamanla farklı ekspresyonlarını kaybetti. Bu durum, KO klonlarında başlangıçta azalmış olan proliferasyon oranının zamanla ortadan kalkmasıyla paralellik gösterdi. Görünüşe göre, KO hücreleri genetik modifikasyona adapte olmuş ve daha proliferatif bir fenotipe geri dönmüştür. EGF reseptör sinyalleşmesinin, EGF uyarılmasını takiben tirozin 992 (Y992), tirozin 1173 (Y1173) ve tirozin 1069 (Y1069) fosforilasyon durumu değişikliklerinin değerlendirilmesi yoluyla yapılan analizi, belirtilen EGFR fosforilasyon bölgelerinde ve ilgili aşağı akış hedeflerinde indüklenen fosforilasyon desenlerinin yoğunluğunda belirgin bir fark ortaya koymadı. Son olarak, SPTSSA KO'nun nöronal farklılaşma üzerindeki etkisini inceledim. Farklılaşma indüksiyonu, hücre ölümünü özellikle SPTSSA KO'da indükleyerek hücre canlılığını azalttı. Ayrıca, SPTSSA KO, kontrol hücrelerine kıyasla mitokondriyal zar potansiyelinde önemli bir artışa neden olurken, mitokondriyal kütlede önemli bir fark yaratmadı. Sabit durumda proteom analizi, mitokondriyal fonksiyondaki olası değişikliklere işaret etmiş olup, bu durum mitokondriyal solunum zinciri kompleksi (I, III ve IV) bileşenlerinin değiştirilmiş ekspresyonuna bağlanmıştır. Özellikle, KO hücrelerinde, kompleks IV'ün çekirdek katalitik alt birimi olan MT-CO2'nin seviyelerinin azaldığını ve kompleks III'ün çekirdek alt birimi olan UQCRC2'nin seviyelerinin arttığını Western blot analizi ile doğruladım. Sonuç olarak, bu çalışma, SPT kompleksinin bileşimindeki değişikliklerin ve C18- veya C20-sfingozin içeren sfingolipidler arasındaki dengenin, hücrelerin proteom, fosfoproteom, metabolom ve lipidomunda değişikliklere ve hücresel geçişler için farklı uyum yeteneklerine yol açabileceğini ortaya koymuştur. Bu bulgular, burada hücre farklılaşması ve mitokondriyal homeostaz için örneklendiği gibi, seramid homeostazını korumanın temel hücresel fizyoloji için önemini vurgulamaktadır.

Özet (Çeviri)

Sphingolipids are essential lipid constituents of cellular membranes and their complex metabolic pathways interconnect amino acid, fatty acid, phosphoglycerolipid and carbohydrate metabolism. They influence the structure of cellular membranes, participate in signal transduction cascades and orchestrate cell-cell communication. Therefore, they contribute to the regulation of numerous cellular processes including proliferation, apoptosis and cellular differentiation. The core of sphingolipids is a sphingoid base, a long chain amino-alcohol, whose synthesis is initiated by the action of the enzyme serine palmitolytransferase (SPT). SPT is a complex of 3 polypeptides and catalyzes the rate-limiting step of the sphingolipid biosynthesis. Therefore SPT activity is regulated, e.g. by inhibiting ORMDL peptides and by feedback regulation through ceramide concentrations in the membrane of the endoplasmic reticulum. Opposite to that the small subunit of the SPT complex (SPTSSA or SPTSSB) enhances the activity of the enzyme and determines the chain length of the final sphingoid bases. The length of the sphingoid bases in ceramides has been shown to have an impact on the properties of the bilayer, especially in influencing the order and fluidity of membranes, which can result in inducing phase separation for the formation of microdomains. As microdomains act as a hub for cell signaling by selectively recruiting or excluding proteins and facilitating the interaction between interaction partners, they are essential for modulating signaling pathways and associated signaling events. It has been shown that the sphingoid base length of ceramide has a greater impact on initiating microdomain formation and intermolecular interactions within the ceramide-rich gel phase as compared to the length of the acyl chain. As longer sphingoid bases tend to enhance stability of the microdomains, this possibly influences the duration and amplitude of associated signaling events. As of now, the latter had not been studied and the physiological roles and biological importance of sphingoid bases with carbon chains exceeding 18 carbons remain unclear. To fill this gap, I successfully generated CRISPR-Cas9 edited SPTSSA knock out (KO) monoclonal neuroblastoma cells (SH-SY5Y). SPTSSA KO caused a decrease in SPT activity and an more than 7-fold increase in the amount of ceramides containing C20-sphingosine as compared to corresponding control cell clones, in line with recent reports in other cellular systems. However, steady state levels of total ceramides were not significantly affected. Compared to ceramides with C18-sphingosine, ceramides with C20-sphingosine were enriched in C22- and C24-acyl chains, while C16-acyl chains were strongly decreased. To study the impact of this shift in ceramide composition on cell homeostasis and function, I monitored the cellular changes in SPTSSA KO cells both at steady state and upon induction of differentiation into neuron-like cells. Through multiomics studies, I revealed that the changes in distribution of ceramide species altered a small subset of the proteome, phosho-proteome and the lipidome of the cell at a steady state. Most pronounced changes were observed in concentrations of soluble metabolites. Comparison of the proteome after generation of the SPTSSA KO clones and after more than 30 passages, reveal a few proteins, which had persistent differential expression between KO and control groups (AHNAK, SLC27A6, MVP, CNTNAP1 SH3PXD2A). However, those proteins associated with cell cycle and proliferation lost differential expression over time. This was paralleled by an initially reduced proliferation rate in KO clones, which vanished over time. Apparently, KO cells adopted to the genetic modification and transitioned back towards a more proliferative phenotype. Analysis of EGF receptor signaling by evaluating the alternations in the phosphorylation status of tyrosine 992 (Y992), tyrosine 1173 (Y1173) and tyrosine 1069 (Y1069) following 10 min of EGF stimulation did not reveal noticeable differences in the intensity of induced phosphorylation patterns at the specified EGFR phosphorylation sites and their respective downstream targets. Finally, I investigated the effect of SPTSSA KO on neuronal differentiation. Induction of differentiation reduced cell viability by inducing cell death specifically in SPTSSA KO. Furthermore, the SPTSSA KO caused a significant increase in the mitochondrial membrane potential as compared to that of control cells while not leading to significant differences in mitochondrial mass. The proteome analysis at steady state already indicated potential modifications in mitochondrial function, which were attributed to altered expression of the mitochondrial respiratory chain complex (I, III, and IV) components. Specifically, I confirmed the decreased levels of MT-CO2, the core catalytic subunit of complex IV, and the increased level of UQCRC2, a core subunit of complex III, in KO cells by Western blot analysis. In conclusion, this study revealed that alterations in the composition of the SPT complex and corresponding ratio of sphingolipids containing either C18- or C20-sphingosine could lead to changes in the proteome, phosphoprotome, metabolome, and lipidome of the cells as well as to differential fitness for cell transitions. These findings underscored the importance of maintaining ceramide homeostasis for fundamental cellular physiology, as exemplified here for cell differentiation and mitochondrial homeostasis.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    723356

    Scenarios and strategies addressing the impact of COVID-19 pandemic on environmental emissions reduction and recovery: Model-based forecasting and sustainability analysis for Turkey

    COVID-19 pandemisinin çevresel emisyonların azaltılması ve iyileştirilmesi üzerindeki etkilerine ilişkin senaryolar ve stratejiler: Türkiye için model bazlı tahmin ve sürdürülebilirlik analizi

    SERAY PEHLİVAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    Kimya MühendisliğiGebze Teknik Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MURAT ÖZDEMİR

    PROF. DR. MEHMET MELİKOĞLU

  2. Tez No

    962040

    Üretken yapay zekânın toplumsal pazarlama stratejileri üzerindeki etkisi: Yeni nesil pazarlama yaklaşımlarıyla ele alınması

    The impact of generative artificial intelligence on social marketing strategies: Addressing new generation marketing approaches

    NOUR DJAREF

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2025

    İşletmeİstanbul Gelişim Üniversitesi

    İşletme Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ MURAT BAŞAL

  3. Tez No

    220833

    The impact of the us unilateralism on international law -The situation of Jus ad Bellum after september 11-

    Amerikan tektaraflılığının uluslararası hukuk üzerindeki etkisi -11 eylül sonrası Jus ad Bellum'un durumu-

    MERVE YÜCE

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2007

    Uluslararası İlişkilerBoğaziçi Üniversitesi

    Siyaset Bilimi ve Uluslararası İlişkiler Ana Bilim Dalı

    Y.DOÇ.DR. AYŞEN CANDAŞ BİLGEN

  4. Tez No

    854234

    Assesing the impact of financial development on economic growth: A global perspective

    Finansal gelişmenin ekonomik büyüme üzerindeki etkisini değerlendirmek: Küresel bir perspektif

    MUHAMMAD TAMMAM AL ASADI

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2024

    MaliyeBahçeşehir Üniversitesi

    Finansal Teknolojiler Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ MERT GÜL

  5. Tez No

    449791

    The impact of banks' csr projects on customers: A research on turkish banking sector

    Bankaların sosyal sorumluluk projelerinin müşteriler üzerindeki etkileri

    SEMA GÜNER

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2012

    İşletmeDoğuş Üniversitesi

    İşletme Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. ESRA ARIKAN

Geri Dön