Bağırsak hasar modellerinde kemik iliği mezenkimal kök hücre ve bağırsak mezenkimal kök hücrelerin rejeneratif ve immün modülatuvar etkilerinin karşılaştırılması
Comparison of regenerative and immune modulatory effecets of bone marrow and intestinal mesenchymal stem cells i intestinal damage models
- Tez No: 919272
- Danışmanlar: DOÇ. DR. FATİMA AERTS KAYA
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Akut GvHD, bağırsak mezenkimal hücreler, kolonoid
- Yıl: 2025
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Hacettepe Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Kök Hücre Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
. Allojenik hematopoetik kök hücre nakli (allo-HKHN), birçok malign veya malign olmayan hematolojik hastalıklar için tek tedavi seçeneğidir. Greft versus host hastalığı (GvHD), allo-HKHN'den sonra donör kaynaklı T hücrelerinin alıcı hücrelerin yüzeyindeki Majör Doku Uyumluluk Kompleksi (MHC) proteinlerine genel tepkisiyle ortaya çıkabilmektedir. Akut GvHD (aGvHD)'nin mevcut klinik öncesi çalışmaları, farelerde önemli rahatsızlıklara ve ölüme yol açabilmektedir. Bu nedenle, bu tez kapsamında, daha az zarara neden olan ve temsili bir hastalık modeli olarak işlev gören alternatif intestinal aGvHD fare modelinin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bağırsak hasarı mevcut skorlama sistemininin uygunluğu test etmek amacıyla ilk olarak immün yetmezliği olan Balb/c-Rag2-/- (Rag2) farelerinde DSS ile İnflamatuvar Bağırsak Hastalığı (İBH) modeli indüklenmiştir. İntestinal aGvHD in vivo ve in vitro modelleri geliştirmek için aktive edilmiş MHC-uyumsuz T hücreler, Rag2 farelerine düşük doz busulfan sonrası infüze edilmiş, Rag2 kolonoidlerile ko-kültür edilmiştir. İntestinal aGvHD indüklendikten sonra kemik iliği ve intestinal mezenkimal stromal/kök hücrelerinin aGvHD şiddeti üzerindeki etkileri, göçü, immün modülatuvar ve rejeneratif potansiyeli değerlendirilmiştir. Geliştirdiğimiz Rag2 intestinal aGvHD modelinde intestinal hasar histolojik açıdan belirgin, ancak bağırsak dışı doku tutulumu az olduğu görülmüştür. Bu nedenle deney sırasında mevcut modellere göre hayvan kaybı görülmemiştir. Ayrıca, in vitro aGvHDin-a-dish modelimizin in vivo modelimize büyük benzerlik göstermesi bu modelin intestinal aGvHD'yi modellemek için uygun ve daha pratik olduğu düşünülmektedir. Birçok malign veya malign olmayan hematolojik hastalıklar için tek küratif tedavi seçeneği allojenik HKH nakli (allo-HKHN)'dir. Allo-HKHN öncesinde hastalara uygulanan radyoterapi veya kemoterapi (hazırlık rejimi) sonrasında özellikle deri ve bağırsaklar gibi hızlı bölünen dokularda ağır hasar meydana gelebilmektedir. Sistemik inflamatuvar hastalık olarak tanımlanan GvHD, allo-HKHN sonrasında donör T hücrelerinin (greft), alıcı (host) hücrelerin yüzeyinde bulunan insan lökosit antijen (Human Leukocyte Antigen, HLA) proteinlerine karşı cevabı ile oluşmaktadır. GvHD'nin süreci akut (a) ve kronik (k) olmak üzere iki ana gruba ayrılmaktadır. aGvHD semptomları genellikle allo-HKHN naklinden sonra ilk 100 gün içerisinde gelişebilmektedir ve aGvHD'ye bağlı olan mortalite oranları %15'e kadar çıkabilmektedir. Crohn Hastalığı (CH) ve Ülseratif Kolit (ÜK)'ten oluşan İBH'de yaygın bağırsak enflamasyonu görülmektedir. Prevalansı yüksek olan İBH'nin nedenleri multifaktöryeldir; genetik yatkınlık, çevresel faktörler ve mukozal immün toleransta bozulma sonucu oluşan aşırı immün yanıt nedenler arasındadır. Crohn transmural enflamasyona, bağırsak granülomlarına, darlıklarına ve internal fistüllere neden olup gastrointestinal sistemin herhangi bir yerini (genelikle terminal ileum) etkilerken, ÜK ise mukozal enflamasyonla karakterize edilir ve etki bölgesi kolonla sınırlıdır. Crohn hastalığı ilerledikçe bağırsak katmanları kalınlaşmaktadır ve karın ağrısı, ishal, enflamasyon ve ateş semptomları görülmektedir. Göz, eklem, kan, karaciğer, böbrek ve pankreas tutulması hastalığın bağırsak dışındaki belirtileridir. ÜK'te başlıca klinik bulgular ishal, rektal ağrı, kasılma tarzında karın ağrısı, ateş ve kilo kaybı ile hastalığın ilerlemesiyle birlikte görülen kanlı ishallerdir. Ayrıca bu hastalarda, hastalığın şiddetine bağlı olarak kolon perforasyonları, akut kolon dilatasyonu, kolon kanseri ve kolon dışında deri lezyonu, göz hastalıkları, karaciğer yetmezliği, kemik ve eklem hastalıkları da oluşabilmektedir. İBH tedavisinde mevcut yaklaşımların arasında, farmakolojik ajanlar ile aşırı immün yanıtın baskılaması ve/veya ileri evre iltihaplanmış bağırsak dokusunun ameliyatla alınması bulunmaktadır. ÜK tedavisi için antidiyaretikler, antispazmodikler ve analjezikler kullanılmaktadır. Hastalığın şiddetine bağlı olarak kortikosteroidler ve immünomodulatuvar ilaçlar (siklosporin, rapamisin, fusidik asit vs) önerilmektedir. Ayrıca IFN-α, anti-TNF antikorları, rekombinant anti-inflamatuvar sitokinler, IL-1, IL-12, IL-16 ve IL-18 reseptör agonistleri, G-CSF ve probiyotikler hastalığın tedavisinde kullanılmaktadır. Crohn hastalığında da mevcut tedaviler remisyonun sağlanması, enflamasyonun azaltılması ve beslenme durumunun düzenlenmesini hedeflemekte ve anti-enflamatuvar ile immünomodülatuvar ilaçlar kullanılmaktadır. Ancak bu hastalıklarda kullanılan ilaçlar/tedavi yöntemleri, küratif tedavi sunmamakla birlikte birçok yan etki göstermektedir. Bu nedenle, İBH'de yeni alternatif tedavilerin geliştirilmesine gereksinim duyulmaktadır. Multipotent mezenkimal kök/stromal hücreler (MKH)'ler; başta kemik iliği olmak üzere, adipoz doku, göbek kordonu ve plasenta gibi birden çok stromal dokudan elde edilebilmektedir. MKH'ler; osteojenik, adipojenik ve kondrojenik yöne farklılaşma yapmakta ve hücre yüzeyinde yüksek seviyede CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 ve CD166 antijenlerini ifade etmektedir. MKH'lerin kendini yenilemesi, hasarlı dokuya göç edebilmesi, immünomodülatuvar özellikleri ve rejeneratif potansiyelinden dolayı klinik çalışmalarda ve hücresel/gen tedavi araştırmalarında kullanılmaktadır. İmmünomodülatuvar ve rejeneratif özelliklere sahip MKH'ler, aGvHD, multipl skleroz, otoimmün romatoid artrit gibi çeşitli otoimmün ve alloimmün hastalıkların tedavisi için klinik olarak test edilmiştir. MKH'ler, yüzeylerinde ifade ettikleri kemokin reseptörü CXCR4 ile Kİ ve hasarlı dokudan salınan CXCL12 (SDF-1) gradiyentine doğru göç etmektedir ve CXCR4/CXCL12 etkileşimi MKH'lerin hasarlı dokuya göçünde (yerleşmesinde) ve hominginde (yuvaya dönmesi ve tutulmasında) ana rol oynamaktadır. MKH'ler göçte daha az etkili olan diğer kemokin reseptörlerini de (CCR1, CCR4, CCR7, CCR9, CCR10, CXCR5 ve CXCR6) değişken seviyelerde ifade etmektedir. Daha önce yayımlanan bir çalışmamızda altın standart olarak kabul edilen tripsin enzimatik yöntemi ile toplanan MKH'lerin yüzey CXCR4 ifadelerinin önemli oranda azaldığı gösterilmiş ve enzimatik olmayan yöntemlerin CXCR4 ifadelerini daha iyi korunduğu tespit edilmiştir. Bağırsak anatomik olarak ince (duodenum, jejunum, ileum) ve kalın (çekum, çıkan kolon, tranvers kolon, inen kolon, sigmoid kolon ve rektum) bağırsaktan oluşmaktadır. Bağırsak mukozası, üzerini örten glikokaliks ile besinler, su ve küçük moleküllere seçici geçiş sağlarken, bakteriler ve patojenlere karşı güçlü bir bariyer oluşturmaktadır. Mukozanın yapısında epitel katını oluşturan goblet hücreleri (mukus salgılama), enteroendokrin hücreler (hormon salgılama) ve enterosit (emilim) bulunurken; Paneth (doğal immünite ve antibakteriyel savunma) hücreleri kript tabanında yer almaktadır. Kolon; villus bulunmaması, düz bir yüzeye sahip olması, Paneth hücrelerini içermemesi ve iki katlı mukus tabakası olması gibi özellikleriyle ince bağırsaktan ayrılmaktadır. Bağırsak epitel hücrelerinin devamlılığı, kript tabanında bulunan Lgr5+ intestinal kök hücre (İKH) tarafından sağlanmaktadır. Organoidler; kök hücre ve niş hücrelerini içeren, ufak, kendi kendiliğinden oluşabilen 3 boyutlu kültürlerdir. Bu organoidler izole edildikleri organa fonksiyonel benzerliklerinden dolayı“petri kabında organ”(organ-in-a-dish) olarak kabul edilmektedir. Organoidler; hücresel organizasyon ve işlevsellik yönünden orijinal (ilk elde edilen) dokunun en küçük fonksiyonel birliğine benzerlik göstermektedir. Bu özelliklerinden dolayı ilaç geliştirilmesi ve rejeneratif tıp amacıyla kullanılabilmektedir. Aynı zamanda bu organoidler, içinde bulunan kök hücrelerin özelliklerini ve mikroçevre/nişin rolünün araştırılması için kullanılabilmektedir. Yapılan ilk organoidler arasında intestinal organoidler bulunmaktadır. Bağırsak organoidleri, tek bir Lgr5+ İKH'den geliştirilebilir ve matriks molekülleri içeren matrijel ile kaplanmış kültür plakalarında 3 boyutlu olarak çoğaltılabilmektedir. Bağırsak organoidleri bağırsak epitelinden oluşan yapılardır ve bağırsakların in vitro modeli olarak kullanılabilmektedir. Kolon organoidler (kolonoid) kendini yenileme kinetiklerine sahiptir ve in vivo köken aldıkları kolona genetik ve fizyolojik olarak benzerlik göstermektedir. Bağırsak organoidleri, bağırsak epitelinin gelişimi ve özelliklerinin in vitro araştırmaları için önemli avantaj sağlamaktadır. Literatürde bağırsak mezenkimal hücrelerinin köklülüğü konusunda farklı görüşler bulunmaktadır. Ayrıca bağırsak mezenkimal kök hücrelerinin bağırsak dokusu dışında farklılaşma potansiyeli, yenileme potansiyeli ve immün modülatuvar potansiyeli daha önce kemik iliği MKH ile kıyaslanmamıştır. Bu bilgiler ışığında, ana hipotezimiz“İmmün yetmezliği olan Rag2 farelerinden elde edilen in vitro kolonoid modeller, aGvHD'nin in vivo fare modellerinde gözlemlenen hücresel ve moleküler hasarı uygun şekilde temsil eder mi?”, ardından ikincil hipotezimiz“B-MKH'ler, aGvHD'nin tedavisi için Kİ-MKH'ler kadar etkili midir?”şeklindedir. Bu tez kapsamında araştırma sorularını cevaplamak için: 1) DSS kullanarak immün yetmezliği olan Rag2 farelerinde bir İBH modelinin geliştirilmesi; 2) Düşük doz hazırlık rejimi ve MHC uyumsuz, aktive edilmiş B6 dalak T hücrelerinin infüzyonu kullanılarak immün yetmezliği olan Rag2 farelerinde bir aGvHD modelinin geliştirilmesi; 3) Bağırsak hasarının makroskobik ve mikroskobik değerlendirmesine dayanarak, tedavilerin etkisini ölçmek için bir skorlama sisteminin modifiye edilerek test edilmesi; 4) Sağlıklı Rag2 farelerinden kolonoidlerin üretilmesi ve kolonoidlerin aktive edilmiş B6 dalak T hücreleriyle birlikte kültür edilerek aGvHD'nin in vitro modellenmesi; 5) B-MKH'lerin eldesi sonrasında, morfoloji, immünofenotip, farklılaşma ve immünomodülatuvar açısından Kİ-MKH'lerle karşılaştırılması; 6) Kİ-MKH infüzyonlarının DSS kaynaklı İBH'de ve B-MKH veya Kİ-MKH'lerin infüzyonlarının T hücresi kaynaklı aGvHD farelerinde bağırsakta hasarlı bölgelere doğru göç etme kapasiteleri ve bağırsak hasarı semptomları üzerindeki etkilerinin karşılaştırılması amaçlanmıştır. Bu amaçlarla modellerin geliştirilmesinden sonra, 1) İmmün yetmezliği olan Rag2 farelerinde İBH ve aGvHD modellerinin oluşturulması; 2) İBH ve aGvHD fare modellerinde bağırsak hasarını ölçmek için bir puanlama sisteminin modifiye edilerek test edilmesi; 3) Rag2 fare kolonoidlerinde in vitro bir aGvHD modelinin oluşturulması; 4) aGvHD modelinde B-MKH'lerin etkilerinin Kİ-MKH'ler ile karşılaştırılması hedeflenmiştir. Bu tez kapsamında, fare B-MKH'leri ve Kİ-MKH'leri aynı farelerden izole edilip morfolojik ve immünofenotipik olarak karşılaştırılmıştır. Hücre yüzey belirteçleri açısından karşılaştırılmış ve CD29 ve CD44 ifadelerinin hem B-MKH'de hem de KİMKH'de yüksek olduğu belirlenmiştir. Ek olarak, her iki MKH tipinde hem CD90+ hem de CD90- hücre popülasyonları görülmüştür. Bağırsak belirteçleri değerlendirildiğinde, genel olarak B-MKH'ler ve Kİ-MKH'lerde ifade oranlarının benzer olduğu, ancak Gli-1 ifadesinin B-MKH'lerde Kİ-MKH'lerden daha düşük olduğu tespit edilmiştir. Bu çalışmada kontrol olarak kullanılan Op9 ve eGFP+ fare kökenli stromal hücre hatları, Kİ-MKH ve B-MKH'ler için tasarlanan aynı antikor paneli kullanılarak immünofenotiplendirilmiştir. Fare MKH'leri için optimum farklılaşma medyum protokollerini belirlemek için, Op9 hücrelerinde 21 gün boyunca belirlenen 6 farklı adipojenik farklılaşma medyumu (ADM) ve osteojenik farklılaşma medyumu (ODM) test edilmiştir. En yüksek düzeyde adipojenik ve osteojenik farklılaşma sağlayan ve aynı zamanda boyanmış kültürlerdeki ORO/ARS içeriğinin yarı kantitatif analiziyle de doğrulanan farklılaşma için ADM-3 ve ODM-1 formülasyonunun tez süresince kullanılmasına karar verilmiştir. Belirtilen farklılaşma medyumlar, ticari olarak temin edilen fare KİMKH Farklılaşma Kiti (R&D Systems) içerisinde bulunan medyumlarla karşılaştırılmıştır. B-MKH'ler ve Kİ-MKH'ler hem ADM-3 veya ODM-1 ile hem de kit içeriğindeki adipojenik veya osteojenik medyumlar ile 14 gün boyunca kültür edilmiştir. Genel olarak, Kİ-MKH ve B-MKH'lerin adipojenik ve osteojenik soya farklılaşma kapasiteleri benzer bulunmuştur. ADM-3 ve ODM-1 ile kültür edilen hücrelerin, R&D kit ile kültür edilenlerle karşılaştırıldığında, sırasıyla mFABP4 ve mOsteopontin'in daha parlak boyanmasıyla sonuçlanmıştır. Kondrojenik farklılaşma medyumu (CDM) için 3 farklı formülasyon Op9 stromal hücre hattı kullanılarak test edilmiştir. Kondrojenik farklılaşma için optimum medyum formülasyonu, 3D kıkırdak peletinin boyutuna ve Alcian mavisi ile boyama sonucunda glikozaminoglikanların varlığına göre seçilmiştir. Daha sonra, CDM-1, CDM-2 ve CDM-3 sırasıyla Stem Cell Technologies ve R&D kitleri ile karşılaştırılmıştır. Farklılaşma kapasiteleri gen ifade değişimleri değerlendirilerek karşılaştırılmış ve Sox9 gen ifadesi en yüksek CDM-3 ile kültür edilen hücrelerde tespit edilmiştir. Bu veriler ile kondrojenik farklılaşmalar için, hem TGF-b3 hem de IGF-1 içeren CDM-3 ile devam etmeye karar verilmiştir. Optimum farklılaşma koşullarımızı belirledikten sonra, seçilen farklılaşma medyumunun (ADM3, ODM-1 ve CDM-3) Op9 stromal hücrelerinin ve taze izole edilmiş Kİ-MKH'lerin gen ifadesi üzerindeki etkileri 1 haftalık farklılaşmadan sonra test edilmiştir. Genel olarak, taze izole edilmiş Kİ-MKH'lerin Op9 stromal hücre hattından daha iyi farklılaştığını ve adipojenik için Pparg, osteojenik için Alpl ve kondrojenik farklılaşma için Sox9 dahil olmak üzere test edilen üç soyun tüm belirteçlerinin hem Op9 hem de taze izole edilmiş Kİ-MKH'lerde arttığı tespit edilmiştir. Daha önce insan Kİ-MKH'lerin CXCR4 ifadesinin tripsin ile toplama sonucunda anlamlı olarak azaldığını göstermiştik. CXCR4 ifadesinin düşük olması hücrelerin göç (migrasyon) kapasitesini etkileyebileceğinden, transplantasyon deneylerinin başlatılmasından önce farklı enzimatik ve enzimatik olmayan toplama solüsyonlarının fare MKH canlılığı ve Cxcr4 ekspresyonu üzerindeki etkileri değerlendirilmiştir. Enzimatik toplama yöntemleri genel olarak yüksek canlılıkla sonuçlanırken, mekanik ve enzimatik olmayan toplama solüsyonları artan hücre ölümüyle ilişkilendirilmiştir. %0,25'lik Trypsin/EDTA kullanımı fare Kİ-MKH'lerin Cxcr4 yüzey ifadesinin azaltırken, enzimatik olmayan hücre toplama solüsyonu korumuştur. Bu nedenle, Cxcr4 ifadesinin Kİ-MKH göç kapasitesi üzerindeki önemini değerlendirmek için ön transplantasyon denemeleri, canlılık düzeylerinin belirlenmesi yapıldıktan sonra Cxcr4düşük ve Cxcr4yüksek hücre popülasyonları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Cxcr4 ifadesinin belirli inkübasyon sürelerinden sonra tekrar ortaya çıkıp çıkmadığını değerlendirmek için Kİ-MKH'ler tripsin edildikten sonra takip edilmiştir. Kİ-MKH'ler DF20 varlığında 37oC'de inkübe edildiğinde Cxcr4 ifadesinin yeniden oluştuğu, ancak 8 saat sonra hala tripsinizasyon öncesi seviyelerine ulaşılmadığı görülmüştür. Ancak, enzimatik olmayan solüsyonlarla toplandıktan sonra Cxcr4 ifadenin >%95 olduğu bulunmuştur. Bu veriler Kİ-MKH'lerin enzimatik yöntem ile toplanan hücrelerin infüzyonu sırasında Cxcr4 ifadesinin hala normal seviyelerin altında ve hasar bölgelerine doğru göçün ciddi şekilde etkilenebileceğini, nakledilen Kİ-MKH'lerin potansiyel rejeneratif veya immün modülatör etkilerini etkileyebileceğini göstermektedir. T hücreleri, Pan T hücre izolasyon kiti kullanılarak 10-12 haftalık erkek C57BL/6 farelerinin dalaklarından izole edilmiştir. İzolasyon sonrası CD3, CD4, CD8, CD19 ve CD45 oranları akım sitometre ile değerlendirilmiştir. CD3+ T hücresi yüzdesi, seleksiyon öncesi %26,2 ± 12,6 ve seleksiyon sonrası %84,2 ± 19,4'e kadar artmıştır. İzolasyonun sonrası, CD3+ T hücreleri 4 veya 7 gün boyunca aktive edilmiştir. T hücreler, farklı konsantrasyon ve kombinasyonlarda anti-CD3e, anti-CD28 ve ile inkübe edilerek 6 farklı medyumun etkileri test edilmiştir. T hücresi proliferasyonu ve klonal genişleme, CFSE testi ile belirlenmiştir. En uygun medyum T hücrelerinin bölünme sayısına göre değerlendirilmiştir. Hücrelerin 7 güne kadar uyarılması klonal ekspansiyonu artırmamış, ancak uzun süreli kültür hücre ölüm oranları artırmıştır. Bu nedenle, T hücre aktivasyonu için kültür ortamı 3 (CM3: DF-20, 5 ng/mL IL-2, 1 µg/mL CD3e ve 1 µg/mL CD28) ile literatürde fare T hücrelerinin stimülasyonu için en çok kullanılan 4 günlük stimülasyon/aktivasyona devam edilmesine karar verilmiştir. Kİ-MKH'lerin ve B-MKH'lerin immünomodülatuvar etkilerini karşılaştırmak amacıyla in vitro aktive edilmiş T hücresi proliferasyon baskılama testleri yapılmıştır. CFSE+/CD3+ T hücreler, 7 gün boyunca Kİ-MKH'ler veya B-MKH'ler ile kültür edilmiştir. MKH'lerin yokluğunda T hücresi proliferasyonu korunmuş ve aktive edilmiş T hücrelerinin floresan yoğunluğu, CM3'lü kontrol kuyularında azalmıştır. KİMKH'lerin immün baskılayıcı kapasitesinin, B-MKH'lerden çok daha güçlü olduğu, sadece %1 Kİ-MKH'li kültürlerde bile T hücresi çoğalma kapasitesinin önemli ölçüde bastırıldığı bulunmuştur. Bunun aksine, B-MKH'lerin T hücresi baskılanması için aynı ortamda en az %3 oranında bulunması gerektiği tespit edilmiştir. En güçlü immünosüpresif kapasiteler Kİ-MKH'lerde %3 ve B-MKH'lerde %10 olarak belirlenmiştir. Bu nedenle, in vivo fare deneylerinde, Kİ-MKH'lerden yaklaşık 3 kat daha fazla B-MKH enjekte etmeye hedeflenmiştir. Kİ-MKH'leri ve B-MKH'leri nakilden sonra izlemek için hücreler floresan boyalarla boyanmıştır. Bu boyaların floresanının dayanıklılığını değerlendirmek için Kİ-MKH'ler boyandıktan sonra 1, 4 veya 7 gün boyunca kültüre edilmiştir. Akım sitometri analizi, boyanmış hücrelerin floresan ışımada önemli bir kayıp olmadan in vitro 7 güne kadar izlenebileceğini göstermiştir. Kİ-MKH'lerin ve B-MKH'lerin kullanıldığı hastalık modellerinde nakilden sonra göç/rejeneratif/immünomodülatuvar etkilerinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. İlk olarak, daha önce yayınlanan çalışmamızda insan Kİ-MKH'lerini toplamak için klinikte kullanılan enzimatik yöntemlerin CXCR4 ifade kaybına yol açtığı bulunmuştur. Bu nedenle, farklı toplama yöntemlerinin fare MKH'lerinin Cxcr4 ifadelerini ve Cxcr4 ifade kaybının migrasyon/rejeneratif/immünomodülatuvar kapasitelerini etkileyip etkilemeyeceği değerlendirilmek istenmiştir. İkinci olarak, fare bağırsak hasarının histolojik incelenmesi için kullanılan mevcut protokoller ya yeterince ayrıntılı olmadığı için ya da fareler yerine insan kullanımı için tasarlanmış olduğundan dolayı mevcut skorlama sisteminin hasar modelimize uygun olacak şekilde modifiye edilmesi ve doğrulamak için İBH modelinin kullanılması planlanmıştır. Rag2 farelerde İBH indüklenmesi için, %3 DSS içme sularına eklenmiş ve fareler 5 gün boyunca izlenmiştir. Tüm fareler, DSS uygulamasından 5 gün sonra kolit benzeri semptomlar göstermiş ve kolitin şiddetinin nakilden önce orta düzeyde olduğu bulunmuştur (disease activity index, DAI skoru 7,0 ± 1,7). İBH'nin doğrulanmasından sonra, farelere Cxcr4düşük veya Cxcr4yüksek Kİ-MKH'ler i.p. nakil edilmiş ve fareler 7 gün boyunca değerlendirilmiştir. Nakledilen fareler günlük olarak izlenmiş; ishal, rektal kanama ve vücut ağırlığında azalma gibi kolit-benzeri klinik belirtiler, her iki tedavi grubunda da hafifletilmiştir. Cxcr4yüksek grubunun DAI skoru 0,3 ± 1,5 (p<0,05) ve Cxcr4düşük grubunun DAI skoru 2,3 ± 0,6 (p<0,005) olarak bulunmuş, Cxcr4yüksek Kİ-MKH'lerin bu fare modelinde İBH'nin klinik tablosunu azaltmada Cxcr4düşük grubundan daha etkili olduğu tespit edilmiştir. Deney sonunda farelerden toplanan çıkan, transvers ve inen kolonların histolojik preparatları değerlendirilmiş ve kolon uzunlukları (çekumdan rektuma) karşılaştırılmıştır. Tedavi edilmemiş kontrol farelerinin kolonlarıyla karşılaştırıldığında, DSS ile İBH indüklenen farelerin kolonları önemli ölçüde daha kısalmıştır (p<0,05). Kolon uzunlukları, Cxcr4düşük ve Cxcr4yüksek Kİ-MKH'lerin transplantasyonunun ardından tedavi öncesi seviyelere dönmüştür. Kolon geçirgenliğini değerlendirmek için FITC-Dekstran, farelere oral yoldan verildikten dört saat sonra, serumdaki varlığı floresan spektrometre kullanılarak ölçülmüştür. DSS verilen farelerin kolon geçirgenliği, kontrol grubu farelere kıyasla artmıştır (p<0,05). DSS verilen farelere Cxcr4yüksek veya Cxcr4düşük Kİ-MKH'ler nakledildiğinde, FITC-Dekstran seviyeleri tedavi öncesi değerlere dönmüştür. Bununla birlikte, Cxcr4yüksek KİMKH'lerle tedavi edilen grup önemli bir iyileşme göstermiştir (p<0,05). Bu nedenle, Cxcr4yüksek ve Cxcr4düşük gruplarının etkileri arasında anlamlı bir fark olmasa da (p>0.05), Kİ-MKH naklinin bağırsak geçirgenliği üzerindeki etkileri ve kolonların morfolojik görünümü, Kİ-MKH'lerin kolon üzerinde güçlü bir rejeneratif veya koruyucu etkisi olduğunu düşündürmektedir. Kİ-MKH'lerin koruyucu etkilerini histolojik olarak değerlendirmek için, tüm farelerin çıkan, transvers ve inen kolonları H&E ile boyanmıştır. Cxcr4düşük veya Cxcr4yüksek Kİ-MKH'lerin nakli, nakledilmemiş DSS pozitif kontrollerine kıyasla, inflamatuvar hücre infiltrasyonu (p<0.05), epitel hasarı (p<0.0001) ve mukozal mimari bozulma (p<0.01) belirtilerini önemli ölçüde azaltmıştır. Genel olarak, histolojik iyileşme kolonun tüm uzunluğu boyunca benzer bulunmuştur. Cxcr4yüksek Kİ-MKH'lerle tedavi edilen fareler genel olarak en fazla iyileşmeyi gösterse de kolon uzunlukları değerlendirildiğinde anlamlı fark bulunmamıştır. Bu nedenle, yüksek Cxcr4 ifadesinin hasar bölgelerine doğru göç açısından bir avantaj sağlayabileceği bilinmesine rağmen Kİ-MKH'lerin genel koruyucu etkilerinin bu İBH modelinde, Kİ-MKH'lerin i.p. uygulandığında Cxcr4 ifadesinden bağımsız olduğu düşünülmektedir. Rag2 farelerin DSS ile tedavisi, goblet hücrelerinin kaybıyla birlikte multifokal mukozal infiltrasyona ve düzensiz yüzey epitel erozyonuna neden olmuştur. DSS verilen pozitif kontrol örneklerinde lamina propria ve submukozal infiltrasyonun tutulumu gözlenmiştir. DSS ile indüklenen kript kaybı, apse oluşumu ve fokal ülserasyon Kİ-MKH'ler ile tedaviden sonra azalmış ve epitel iyileşmesi ve mukozal tabakanın rejenerasyonu düzensiz kriptlerin ortaya çıkmasıyla belirginleşmiştir. Çıkan, trans ve inen kolonlar ayrı ayrı değerlendirilmesinde, aynı farelerden veya aynı tedavi grubundan ortalama olarak farklı kolon bölgeleri benzer hasar puanları alarak tüm kolon eşit olarak etkilendiği anlaşılmıştır. Alıcı Rag2 farelere, düşük seviyeli bağırsak hasarı oluşturmak için ilk olarak 25 mg/kg Busulfan (BU) uygulanmıştır. Ertesi gün, farelere i.p. 1x106 aktive edilmiş CD3+ dalak T hücresi enjekte edilmiştir. İBH modeline benzer şekilde, fareler 7 gün süreyle günlük olarak izlenmiştir. aGvHD semptomları farelerde klinik bir aGvHD puanlama sistemi kullanılarak değerlendirilmiştir. aGvHD benzeri klinik tablonun açık belirtilerini gösteren fareler (skor >2, aGvHD derecesi 2 ve üzeri) daha sonra 1x106 BM-MSC (n=3) veya 2,3 x106 I-MSC (n=3) ile tedavi edilmiştir ve 7 gün daha takip edilmiştir. MKH infüzyonundan 7 gün sonra, klinik değerlendirme tekrarlanmış ve tedavi öncesi ve sonrası aGvHD derecesi belirlenmiştir. İBH modeliyle elde edilen verilere dayanarak, infüzyon için hazırlanan MKH'ler standart Trypsin/EDTA toplama yöntemi ile toplanmıştır. B-MKH enjekte edilen iki fare, büyük olasılıkla emboli (hava veya hücre kümeleri) nedeniyle infüzyon sırasında öldüğünden toplam B-MKH'lerle tedavi edilen yalnızca bir farenin verileri kullanılmıştır. Hayvanlar sakrifiye edildikten sonra donör kaynaklı lenfositlerin varlığı periferik kan, kemik iliği ve dalaklar da analiz edilmiştir. Rag2 farelerde T ve B hücreleri bulunmadığından T hücre infüzyon sonrası dokularda bulunan tüm T hücrelerin donor kaynaklı olması beklenmektedir, ancak hematopoetik kök hücre nakli yapılmadığından varolan T hücre sayıları sınırlı olması beklenmektedir. Akım sitometri verilerimize dayanarak, hematopoetik dokuların hiçbirinde yüksek düzeyde T hücresi tutunması tespit edilmemiştir. BU'nun (aGvHD negatif kontrol, n=4), BU + T hücrelerinin (aGvHD pozitif kontrol, n=3), BU + T hücrelerinin + Kİ-MKH'lerin (Kİ-MKH tedavi grubu, n=3) ve BU + T hücrelerinin + B-MKH'lerin (B-MKH tedavi grubu, n=1) bağırsak geçirgenliği üzerindeki etkilerini değerlendirmek için, hayvanlara oral yoldan FITC-Dekstran verilmiş ve 4 saat sonra serumdaki FITC-Dekstran düzeyleri T hücresi tedavisinden sonraki 7. günde ve 14. günde (MSC naklinden sonraki 7. günde) floresan spektrometrisi kullanılarak değerlendirilmiştir. Rag2 farelerinin BU ile tedavisi, tedavi edilmeyen kontrollerle karşılaştırıldığında kilo kaybına ve bağırsak geçirgenliğinde orta düzeyde bir artışa (p<0,03) neden olmuştur. T hücreleri ile infüzyon, BU ve T hücresi enjeksiyonundan 7 gün sonra bağırsak geçirgenliğinde büyük bir artışla birlikte bir inflamatuar yanıta neden olmuştur. Hem Kİ-MKH'ler (n=3) hem de B-MKH'ler (n=1) ile yapılan tedavi, bağırsak geçirgenliğini ve farelerin ağırlığını hızla normale döndürmüştür. Daha sonra, BU ve T hücresi infüzyonunun kolon histolojisi üzerindeki etkileri H&E boyama sonrası değerlendirilmiştir. Goblet hücrelerinin salgılama fonksiyonunu değerlendirmek için Alsiyan Mavisi/Periyodik asit Schiff (PAS) boyaması kullanılmıştır. Tüm kesitler DSS fare modeli için test edilen ve optimize edilen skorlama sistemine göre değerlendirilmiştir. Klinik puanlamadan elde edilen verilerle tutarlı olarak, BU ve BU + T hücresi ile tedavi edilen tüm hayvanların çıkan, transvers ve inen kolon örneklerinde yaygın epitel hasarı ve goblet hücreleri ile kriptlerde kayıp tespit edilmiştir. Çıkan, tranvers ve inen kolonlar ayrı ayrı değerlendirilmesine rağmen, aynı farelerden veya aynı tedavi grubundan ortalama olarak farklı kolon bölgeleri benzer hasar puanları almıştır. BU ve BU + T hücresi grupları benzer mukozal tutulum ve epitel kaybı (p>0,05) göstermiştir, ancak Rag2 tedavi edilmemiş kontrol grubuna göre önemli ölçüde daha fazla epitel hasarı (p<0,05) ve mukozal tutulum (p<0,01) göstermiştir. Genel olarak, mononükleer inflamatuvar hücre infiltrasyonu gözlenmemiş ve Rag2 fareleri immün yetersiz olduğundan hasar tunika mukozasıyla sınırlı kalmışıtr. Kİ-MKH'ler (n=3) ve B-MKH'ler (n=1) ile tedavinin aGvHD benzeri semptomlar üzerindeki koruyucu etkileri aynı yöntem kullanılarak değerlendirilmiştir. BU, 5x106 T hücresi ve 1x106 T hücresi nakil edilen farelerin kolonları, kolonun tüm segmentlerinde sağlıklı kontrol grubuna kıyasla benzer epitel hasar, mukoza hasarı ve inflamatuar hücre infiltrasyonu belirlenmiştir. Bozulma tüm kolon bölgelerinde aynı düzeyde gözlenmiştir. Hasarın indüklenmesinden sonra, 1x106 Kİ-MKH ile tedavi edilen grup, tedavi edilmemiş, sağlıklı kontrol grubunun yapısına benzer bir seviyede, epitel ve mukozal hasar gerilemiştir. 2,3x106 B-MKH tedavisi active T hücresi infüzyonu sonrası oluşan bağırsak hasarı geriletmiştir, ancak bu deneyin sonuçları sadece 1 farede değerlendirildiğinden istatistiksel analiz yapılamamıştır. 2,3x106 B-MKH uygulanması, BU grubu, BU + 5x106 T hücre grubu ve BU + 106 T hücre grubu ile karşılaştırıldığında kolonun tüm segmentlerinde epitel hasarını önemli ölçüde azaltmıştır. Benzer şekilde, mukozal hasar, BU grubu, BU + 5x106 T hücre grubu ve BU + 106 T hücre grubu ile karşılaştırıldığında, kolonun tüm segmentlerinde 1x106 Kİ-MKH tedavisi ile azaltılmıştır. BU, BU + 5x106 T hücre ve BU + 106 T hücre ile tedavi, kolonun tek katlı prizmatik epitelinde hiperplazi ve Goblet hücre kaybına, ardından düzensiz kript yapısına ve kaybına neden olmuştur. Tunika mukozasında epitel ve lamina propria dahil olmak üzere önemli erozyon odak alanları gözlemlenmiştir. Rag2 farelerinde, kolon mukozasında ve submukozada makrofajlar ve lökositler içeren hücre infiltratları gözlemlenmiştir. Hiperplazi ve Goblet hücrelerinin kaybını izleyen epitel hasarı erozyona neden olmuştur. Mukozal hasarın düzensiz kript yapısına, kript kaybına ve granülasyon dokusunun oluşumuna yol açtığı bulunmuştur. Tüm gruplardan alınan deri örneklerinde, retiküler dermis boyunca sağlıklı kıl kökleri ve iyi organize olmuş kolajen lifleri gözlemlenmiştir. Deri örneklerinin inceliği nedeniyle papiller dermisin tüm yapısı gözlemlenememiş, ancak T hücreleri tespit edilmemiştir. Karaciğer örnekleri tüm gruplarda sağlıklı yapılar göstermiş, ancak sinüzoidler ve portal alandaki genişlemiş damarlardan kaynaklanan vasküler konjesyonlu hepatik nodüller gözlenmiştir. Hepatik sinüzoidler ve portal triad bölgeleriyle birlikte parankimal yapı normal bulunmuş ve portal inflamasyon veya zonal nekroz gözlenmemiştir. Gen ifade analizleri için tüm deneyler sonrasında hayvanlardan, çıkan, transvers ve inen kolonun küçük parçaları toplanarak ve Siklin D1, Lgr5, Sitokeratin 20 ve Kromogranin A'nın RT-PCR analizinde kullanılmıştır. Kİ-MKH ve B-MKH'lerin birbirinden farklı olabildiğinden etkileşim mekanizmalarının de farklı olabildiği ortaya çıkmıştır. Bağışıklık eksikliği olan Rag2 fare modelini kullanan bir in vivo modelin geliştirilmesine ek olarak, in vivo modele benzeyen bir in vitro aGvHD kolonoid modeli de oluşturulması amaçlanmıştır. Sağlıklı kolonoidler ilk kez Rag2 farelerinden elde edilmiş ve P3'e kadar kültüre edilmiştir. Bu hayvanlar, bağışıklık sistemleri hariç, genel olarak sağlıklı oldukları, normal iştahları ve normal büyümeleri olduğu için, tedavi edilmemiş Rag2 fareleri ile diğer sağlıklı fare modelleri arasında morfoloji veya işlevde herhangi bir olağanüstü değişiklik veya farklılık beklenmemiştir. Buna paralel olarak, bu farelerden izole edilen kriptleri standardize ortamda kültürlediğimizde, kolonoidler başarıyla elde edilebilmektedir. Kültürler, 221S958 proje numarası kapsamında satın alınan canlı hücre görüntüleme sistemi (BlueRay, #EZ-Scope-101) ile sürekli olarak izlenerek, 30-60 dakikalık aralıklarla çekilen fotoğraflar videolara dönüştürülmüştür. Kriyoprezervasyondan sonra canlılığı değerlendirmek için kolonoidler çözülmüş ve P2'de kültüre edilmiştir. Kolonoidlerin dondurulması/ çözülmesinden sonra kolonoidlerin canlılığı genellikle yüksek olarak bulunmuştur. Organoidlerin karakterizasyonu amacıyla, organoidler kolonositler için antiSitokeratin 20, enteroendokrinler için anti-kromogranin A ve goblet hücreleri için anti-Muc-2 ile IF ile ve epitel hücre kompozisyonu içine H&E ile boyanmıştır. Zamanla kendiliğinden organize olarak lümeni çevreleyen dış bir tabaka oluşturan kolonoidler boyunca yerleşmiş tüm hücre alt kümeleri tespit edilmiştir. Ek olarak, yalnızca çok düşük sayıda Kaspaz 3 pozitifliği tespit edilmiştir, bu da Rag2 kolonoidlerinin genel olarak sağlıklı ve işlevsel olduğunu göstermektedir. Kolonoidlerde aGvHD'yi modellemek için, kırmızı floresanla boyanmış CD3+ T hücreleri 4 gün boyunca aktive edilmiş ve sağlıklı Rag2 kolonoidleriyle 4 ve 7 gün boyunca birlikte kültür edilmiştir. Ko-kültür sonunda, T hücresi ve kolonoid canlılığı floresan mikroskop altında değerlendirilmiştir. Burada, aktive edilmiş T hücrelerinin varlığında inkübe edilen Rag2 kolonoidlerinin, organoidlerin lümenlerindeki lenfositlerin varlığından ve FITCDekstran ile boyanarak gösterildiği gibi artan geçirgenlikten anlaşılacağı üzere ciddi bütünlük kaybı belirlenmiştir. Ek olarak, EZ-scope sistemini kullanarak, aktive edilmiş T hücrelerinin sağlıklı bir kolonoidde nasıl hasar oluşturduğu gerçek zamanlı olarak gözlemlenmiştir. Kolonoidler, MHC uyumsuz donör farelerden alınan aktive edilmiş T hücreleriyle birlikte kültürlendiğinde, bu hücreler hızla kolonoidlere saldırarak 24 saat içinde apoptoza neden olmuştur. Ancak, zaman kısıtlamaları nedeniyle Kİ-MKH'lerin veya B-MKH'lerin koruyucu etkilerini in vitro modelde test edilememiştir. Bu tez çerçevesinde, immün yetmezliği olan Rag2 farelerinde DSS ile İBH indüklenmesi ve uyumsuz B6 dalak T hücreleri ile aGvHD indüklenmesi planlanmıştır. Bu modeller kullanılarak, bir bağırsak hasarı puanlama sisteminin test edilmesi ve aynı zamanda in vitro kolonoid hastalık modelleri için bir kontrol görevi görebilecek bir fare modelinin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu kapsamda, ana hipotezimiz“İmmün yetmezliği olan Rag2 farelerinden elde edilen in vitro kolonoid modeller, aGvHD'nin in vivo fare modellerinde gözlemlenen hücresel ve moleküler hasarı uygun şekilde temsil eder”, ikincil hipotezimiz“Bağırsak MKH'leri, aGvHD tedavisinde Kİ-MKH'leri kadar etkilidir”şeklinde olmuştur. B-MKH'ler bilinen Kİ-MKH belirteçlerinin yüksek seviyelerini ifade ederken, KİMKH'ler literatürde bağırsak belirteci olarak ifade edilen Gp38 ve Gli-1'in ifadesi yüksek oranda tespit edilmiştir. Gli-1, Hedgehog sinyal (Hh) yolunun aşağı akışında işlev gören bir transkripsiyonel efektördür ve embriyonik gelişim sırasında doku örüntüleme/farklılaşmanın (morfogenez) düzenlenmesinde önemli bir rol xxiii oynamaktadır. Bununla birlikte, bağırsak dahil olmak üzere belirli farklılaşmış dokularda da ifadesi görülmüştür. Hh-Gli-1 yolunun çoğu yetişkin dokuda inaktif olduğu bulunsa da kök hücrelerin bir alt kümesinde aktivitesini sürdürdüğü gösterilmiştir. Örneğin, Gli-1 ifadesi gösteren mezenkimal hücrelerin, bağırsak kök hücrelerinin ve bağırsak epitel homeostazının korunmasını destekleyen ve Wnt salgılayan temel bir niş oluşturduğu gösterilmiştir. Ek olarak, Hh/Gli-1 sinyalinin memeli bağırsağında inflamatuar yanıtların uygun şekilde düzenlenmesi için gerekli olduğu ve düzensizliğin İBH gelişiminde rol oynayabileceği gösterilmiştir. Buna göre, Gli-1'in potansiyel bir terapötik hedef olarak hizmet edebileceği öne sürülmüştür. Son zamanlarda, Gli-1 nakavt modelleri kullanılarak, Gli-1+ MKH'lerin in vivo'daki birden fazla dokudan gelen MKH'ler için evrensel bir belirteç olarak kullanılabileceği ve Gli1+ MKH'lerin kardiyopulmoner sistem, intestinal sistem, karaciğer, böbrek, diş ve kemik boyunca bulunabileceği gösterilmiştir. Bu nedenle, Gli-1, Kİ-MKH'ler için standart olarak bir belirteç olarak kullanılmasa da en yüksek rejeneratif kapasiteye sahip Kİ-MKH'lerin bir alt popülasyonunu tanımlamak için potansiyel olarak kullanılabilecektir. Daha sonra Kİ-MKH'lerin ve B-MKH'lerin farklılaşma ve immünomodülatör potansiyeli değerlendirilip karşılaştırılmıştır. Fare MKH kültürleri için makul fiyatlı, ticari olarak temin edilebilen farklılaşma medyumu veya kitlerinin eksikliği, bu MKH'lerin farklılaşma kapasitelerinin karşılaştırılması için daha kolay ve daha ucuz protokollerin geliştirilmesini sağlamıştır. Bu nedenle 6 farklı adipojenik ve osteogenik farklılaşma formülasyonunun yanı sıra 3 farklı kondrojenik farklılaşma ortamı test edilmiştir. Fare MKH'lerinin farklılaşması için kullanılan mevcut protokoller, fare suşundaki farklılıklar, izolasyon ve kültür yöntemlerindeki farklılıklar ve farklılaşma protokollerindeki farklılıklar nedeniyle farklılaşmanın verimliliğinde geniş bir varyasyona neden olabilmektedir. Verilerimiz her türlü fare MKH'sinde ve her koşulda eşit derecede etkili olmasa da, formülasyonları yalnızca taze izole edilmiş fare MKH'lerde değil, aynı zamanda Op9 MKH hattında ve eGFP+ kemik iliği kaynaklı MKH'lerde test ederek geniş çapta uygulanabilir medyumlar geliştirilmiştir. Daha önceki çalışmalarda kullanılan adipojenik farklılaşma medyumları DMEM'den (düşük glikoz [LG] 1.0 veya yüksek glikoz [HG] 4.5 g/L) veya aMEM'den (1.0 g/L glikoz) oluşmaktadır ve insülin, indometasin, izobütilmetilksantin, deksametazon ve %10 FBS ile desteklenmektedir. Ek olarak, adipojenik farklılaşmayı desteklenmesi için at serumu, tavşan serumu, L-askorbik asit, rosiglitazon ve eikosatetraynoid asit gibi katkı maddeleri test edilmiştir. Burada, bazal ortamın glukoz seviyesiini artırmak gibi basit bir modifikasyonun adipojenik farklılaşmayı kolaylaştırdığı bulunmuştur. Bu sonucun beklenmedik olmadığı, daha önce diğer araştırmacıların artan glikoz seviyelerinin ROS üretimi ve PKCb aktivasyonunu indükleyebileceğini göstermesiyle belirlenmiştir. Ayrıca, yüksek glikozlu ortamların PPARγ transkripsiyonunu uyardığı, lipit birikimini desteklediği ve lipit damlacıklarının boyutunu artırdığı da gösterilmiştir. Osteojenik farklılaşma medyumunda temel ortam olarak a-MEM veya DMEM-LG'den oluşmakta ve FBS, L-Askorbik asit (L-AA) veya askorbik asit-2-fosfat (AA-2P), deksametazon ve βGliserofosfat ile desteklenmektedir. Bu çalışmada, L-AA, βGP ve DEX konsantrasyonlarını değiştirilerek osteojenik farklılaşma medyumları test edilmiştir. Ancak, genel farklılaşma kapasitesinde büyük bir fark bulunamamıştır ve tüm kültürler ARS boyama için yüksek pozitiflik göstermiştir. Bu nedenle, daha önce laboratuvarımızda test edilip kullanılan ve insan Kİ-MKH'lerinin farklılaşması için optimize edilmiş osteojenik farklılaşma protokolümüzün fare MSC'lerinde de başarıyla kullanılabilecektir. Gerçekten de, R&D Systems marka ticari olarak temin edilebilen fare MSC farklılaşma kiti ile yapılan karşılaştırma, ARS/ORO boyama ve mOsteopontin/mFABP4 ifadesi açısından hiçbir farkın olmadığını ortaya çıkarmıştır. Kondrojenik farklılaşma medyumu, ITS+ premiks, pirüvat, L-AA/AA-2P, prolin ve BMP2 ile veya BMP-2 olmadan TGF-b1 veya TGF-b3 ile desteklenmiş DMEM-HG'den oluşmaktadır. Kondrojenik farklılaşma genellikle Alcian Blue, Toluidin Blue veya Safranin O boyamaları kullanılarak 3D peletlerin glikozaminoglikan içeriklerinin ölçülmesiyle değerlendirilmektedir. Ek olarak, kondrosit farklılaşması esas olarak cinsiyet belirleme bölgesi Y (SRY)-box 9 (Sox9) geni tarafından düzenlenir ve bu nedenle Sox9 ifadesindeki artışlar kondrojenik farklılaşmayı göstermektedir. Aktivasyondan sonra, Sox9 bir transkripsiyon faktörü olarak işlev görmektedir ve birlikte kondrojenik farklılaşmayı ve kondrositlerin yapımını başlatan Sox5 ve Sox6 proteinlerinin ifadesini indüklemektedir. IGF-1, IGF-1 reseptörünün aktivasyonu yoluyla kondrojenik farklılaşmayı destekleme yeteneği nedeniyle, kondrojenik farklılaşma medyumuna eklenmiştir. IGF-1, pro-insüline benzer özelliktedir ve bu nedenle kondrosit proliferasyonunu desteklemekte, hücre dışı matris üretimini artırmakta ve kondrosit apoptozunu engellemektedir. Beklendiği gibi, IGF-1'in eklenmesinin fare MKH'lerin kondrojenik farklılaşmasını desteklediği bulunmuştur. Taze izole edilmiş Kİ-MKH ve B-MKH ile iki farklı fare MKH hücre hattının (Op9 stromal hücreleri ve eGFP+ Kİ-MKH) kullanılarak fare MKH'lerinin farklılaşması için protokoller geliştirilmiştir. Adipojenik ve osteojenik soy hattına doğru bir farklılaşma sağladığı tespit edilmiştir. Ancak, kondrojenik farklılaşmanın test edilmesi için yeterli sayıda BMKH hücresi elde edilememiştir. Bu nedenle yeterli sayıda hücre çoğaltılmasının ardından bu testlerin tamamlaması hedeflenmiştir. Bu tez ile, Kİ-MKH'ler ve B-MKH'ler arasında morfoloji, immünofenotip ve farklılaşma açısından önemli farklılıkların olmamasının aksine, klinik kullanımları için çıkarımları olabilecek iki MKH tipi arasında önemli bir fark ortaya çıkarılmıştır. Gli-1 ifade eden B-MKH'ler inflamasyon ve bağışıklık tepkisinin düzenleyicileri olsa da, hücrelerin kendileri bağışıklık baskılanması açısından daha az etkili görünmektedir. In vitro ortamda yapılan T hücre baskılanması deneyi sonucunda, Kİ-MKH'lerde görülen bağışıklık baskılanması seviyesini elde etmek için en azından 3 kat daha fazla B-MKH gerektiği bulunmuştur. Bu verilere dayanarak aGvHD modelimizde B-MKH'leri KİMKH'lerden 3 kat daha fazla infüze edilmesi amaçlanmıştır. Ancak, nakil için gereken öngörülen 3x106 B-MKH yerine hücre sayısının yetersizliğinden dolayı 2,3x106 hücre/fare kullanılmıştır. Kİ-MKH'lerin bir İBH veya aGvHD modeline nakilden sonra göç etme/rejeneratif/immünomodülatör etkileri değerlendirilmiştir. Ancak, nakil denemelerinin başlatılmasından önce ele alınması gereken bazı sorunlar vardı. İlk olarak, daha önce insan Kİ-MKH'leri için kullanılan toplama yöntemlerinin Cxcr4 ifadesinin kaybına yol açtığı yaptığımız çalışma ile bulunmuştur. Bu nedenle, farklı toplama yöntemlerinin fare MKH'lerinin Cxcr4 ifadesini etkileyip etkilemeyeceğini ve eğer öyleyse Cxcr4 ifadesininin kaybının göç etme/rejeneratif/immünomodülatuvar kapasitelerini etkileyip etkilemeyeceği değerlendirilmek istenmiştir. İkinci olarak, histolojik değerlendirmeler için kullanılan mevcut skorlama sistemleri, yeterince ayrıntılı ve belirgin değildi ve birçoğu fareler yerine insan kullanımı için tasarlanmıştı, bu nedenle histolojik inceleme kullanarak fare bağırsak hasarının mevcut bir skorlama sistemini modifiye edip test etmek için İBH modeli kullanılmak istenmiştir. Kİ-MKH'leri toplamak için farklı enzimatik ve enzimatik olmayan toplama yöntemleri kullanılmıştır. Test edilen tüm enzimatik yöntemlerde hücre canlılığı yüksek iken, pipetleme ve kazıma gibi fiziksel yöntemleri ve enzimatik olmayan solüsyonlar ile hücre canlığı azalmıştır. Cxcr4 seviyeleri ise buna ters orantılı olarak enzimatik olmayan yöntemlerle toplanan hücrelere kıyasla ciddi şekilde azalmıştır. Cxcr4yüksek ve Cxcr4düşük Kİ-MKH'ler İBH modeli farelerde benzer iyileşme sağlamıştır. Bu durumda, hücrelerin hasarlı bölgeye göç etmesinde yüksek Cxcr4 ifadesinin gerekli olmadığı sonucuna varılmıştır. Ayrıca, hücrelerin lokal olarak periton boşluğuna enjekte edilmesi de bu sonucu desteklemektedir. Bu çalışmadan elde edilen veriler yakın zamanda Clinical and Translational Science'da yayınlanmıştır. Erben ve ark. tarafından yayınlanan, farelerde bağırsak hasarı değerlendirme kriterleri, hem kullanılan donor faresinin hem de bağırsak hasarını oluşturan etmenlerin özelliklerine göre yalnızca İBH'nin değil aynı zamanda intestinal aGvHD'nin de değerlendirilmesi için kullanılabilen skorlama sistemi bu tez kapsamında modifiye edilip optimize edilmiştir. Her iki hastalık modelinde de, inflamatuvar hücre infiltrasyonu, epitel hücre hasarı ve mukozal mimarinin varlığının değerlendirilmesinde çok yararlı olduğunu kanıtlanmıştır. Rag2 fareleri kullanılarak bir aGvHD in vivo modelinin oluşturulması ve paralel olarak bu farelerden elde edilen kolonoidler kullanılarak bir in vitro aGvHD-in-a dish modelinin geliştirilmiştir. İlk olarak aGvHD'yi indüklemek için gereken BU dozu belirlenmiştir. Yüksek doz BU, daha önce yayınlanmış sağlıklı Balb/c fare aGvHD modellerinde istenmeyen ölümlere yol açabildiği bilindiği için, ilk olarak immün yetmezlikli Rag2 farelerine tek bir düşük doz BU tedavisi yapılmıştır. İntestinal aGvHD indüksiyonu için T hücrelerinin hasarlı bağırsağa yönlenmesi için belirgin seviyede bağırsak hasarı gerektirdiğinden dolayı, BU ile ön tedavi mecburen yapılmıştır. Modelimiz için genel (tüm vücut) bir aGvHD tutulumu yerine, sadece gastrointestinal sistem üzerindeki etkilerin değerlendirilmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla, tek bir BU dozu kullanarak, T hücrelerini hasar bölgelerine yönlendirmek için yeterli bağırsak hasarı indüklenebilmiştir. T hücre nakli sonrası aGvHD benzeri semptomlar farelerde oluşmuştur, bağırsak geçirgenliği artmış ve modifiye edilmiş skorlama sistemi ile epitel hücre hasarına, mukozal hasara ve inflamatuar hücre infiltrasyonuna neden olduğu histolojik olarak doğrulanmıştır. Kİ-MKH ve B-MKH tedavi sonrasında, farelerde DAI ve aGvHD derecelendirmesinde klinik iyileşme olarak tanımlanabilecek bir azalma görülmüştür. Bu tezin süresince ancak 1 adet fare in vivo B-MKH ile tedavi edildiği için istatistik analizinin yapılması mümkün olmamıştır. Ancak genel olarak fareleri klinik ve histolojik olarak değerlendirdiğimizde Kİ-MKH nakil edilen gruptakine benzer bir rejenerasyon veya koruma düzeyi gözlemlenmiştir. Ancak, daha önce BMKH'lerin in vitro immün modülatuvar özelliklerinin Kİ-MKH'lerden daha az etkili olduğunu belirlendiğinden, in vivo B-MKH dozu Kİ-MKH'lerin 2,3 katı kadar kullanılmıştır. Tez kapsamında B-MKH'ler izole edilip, coğaltıp klinikte uygulanması için uygunluğunun değerlendirilmesi amacımız değildir. Ancak, bu hücrelerin potansiyel rejeneratif ve immün modülatuvar özelliklerinin değerlendirilmesi ile birlikte gelecekteki projelerde bu hücrelerin in situ dışarıdan verilen uyarılar ile aktive edilmesi ve bu şekilde İBH veya intestinal aGVHD'nin kullanımında olası potansiyelinin değerlendirilmesi hedeflenmiştir. Bu nedenle, amacımız öncelikle bu hücrelerin potansiyelini değerlendirmek ve daha sonra bu hücreleri in situ veya in vivo olarak aktive etmenin mümkün olup olmadığını araştırmaktır, böylece donör Kİ-MKH infüzyonlarına olan ihtiyaç azalacaktır. Ancak, B-MKH'lerin potansiyel etkileri hakkında daha net bir fikir edinmek ve istatistik analizleri yapabilmek için ve KİMKH'lerin ve B-MKH'lerin in vivo rejeneratif ve immün modülatuvar potansiyelinde herhangi bir fark olup olmadığını görebilmek için B-MKH nakilleri tamamlanacaktır. Bununla birlikte, farelerimizde HKHN yapılmamasına rağmen, temel bağırsak hasarını oluşturmak için düşük doz BU kullanan ve ardından Rag2 farelerine düşük doz aktive edilmiş T hücresi infüzyonu uygulanan mevcut modelin, deri veya karaciğerin katılımı olmaksızın aGvHD'yi incelemek için bir model olarak kullanılabilecektir. In vitro aGvHD modelinin çalışmalarından önce in vivo modelimizde elde edilen kolon örneklerinde kolonosit, enteroendokrin hücre ve Lgr5+ İKH'lerin gen ifadesi değişimleri RT-PCR ile değerlendirilmiştir. Ayrıca UC ve Kolit'te ifadesinin arttığı bilinen hücre döngüsünde rol oynayan Cyclin D1 gen ifadesine de bakılmıştır. Cyclin D1 ifadesi, tüm gruplarda kontrole göre yüksek bulunmuştur. BU + T gruplarında, Cyclin D1 ifade artışı, CD8+ T hücresi yanıtının, vasküler endotelyal büyüme faktörü-C (VEGF-C)'nin PI3K/AKT ve Cyclin D1 sinyal yolu ile teşvik edilmesinin sonucu olarak açıklanmaktadır. Steroidler ve TNF-a varlığında, MKH'ler tarafından üretilen parakrin faktörlerin arasında yüksek oranda VEGF-3 olduğu ve VEGF-3 yoluyla MKH'lerin bağışıklık destekleyici özelliklerinin baskılanarak T hücre proliferasyonunu artırabileceği bilinmektedir. Tüm in vivo deney gruplarının tamamlanmasının ardından yapılacak ELISA testleri ile serumdaki TNF-a seviyesinin belirlenmesi ile, tedavi gruplarında cyclin D1 ifade artışının nedeni net olarak belirlenebilecektir. Lgr5+ ifadesinin kontrol grubunda düşük olması, İKH'ler kolonda ve ince bağırsakta farklılıklar gösterebildiğini ve bağırsakta daha yavaş hücre döngüsüne sahip ve Lgr5 ifade etmeyen kök hücrelerin de bulunduğunu desteklemektedir. Tüm gruplarda kolonositlerin kısmi olarak hasar gördüğü bölgeler mevcuttur. Bu göz önüne alındığında RNA izolasyonu için alınan bölgede bu hücrelerin lümene dökülüp ortamdan uzaklaşma ihtimalleri göz önüne alınmalıdır. Rag2 farelerinden kolonoidler ilk kez bu tez kapsamında izole ve karakterize edilmiştir. Balb/c kökenli Rag2 fareleri, bağışıklık sistemleri hariç, genel olarak sağlıklı oldukları için, diğer sağlıklı fare modelleri ile morfolojik veya işlevsel herhangi bir olağanüstü farklılık beklenmemektedir. Bu nedenle bu farelerden izole edilen kriptler standardize edilen ortamda kültür edildiğinde, kolonoidler hızla oluşmuş ve pasajlanarak haftalarca in vitroda çoğalma potansiyeli gösterilmiştir. Kolonoidlerin karakterizasyonu için kolonositler Sitokeratin 20, enteroendokrin hücreler kromogranin A ve goblet hücreleri anti-Muc-2'ye karşı antikorlarla işaretlenmiştir. Ek olarak, kolonoidlerdeki sağ kalımı değerlendirmek için apoptoz belirteci olan Kaspaz 3 ifadesi değerlendirilmiştir. Kolonoidler boyunca dağılmış tüm hücre alt kümeleri floresan mikroskop değerlendirmeleri ile tespit edilmiş ve bu epitel hücrelerin zamanla kendiliğinden organize olarak lümeni çevreleyen dış bir tabaka oluşturdukları gözlenmiştir. Ek olarak, Rag2 kolonoidlerinin genel olarak sağlıklı ve işlevsel olduğu, çok düşük miktarda Kaspaz 3 pozitifliği ile gösterilmiştir. Kolonoidler, MHC uyumsuz aktive edilmiş T hücreleriyle birlikte kültür edildiğinde, bu hücreler hızla kolonoidlere saldırarak 24 saat içinde yüksek permeabilite artışıyla birlikte apoptoza neden olmuştur. In vivo modelimizde olduğu gibi kolonoidlerde de permeabilite artışı için FITC-Dekstran deneyi yapılmıştır. aGvHD indüklenmiş kolonoidlerde yarım saatin sonunda permeabilize artışı FITC-Dekstran'ın lümene geçişiyle belirlenmiştir. Ancak, zaman kısıtlamaları nedeniyle Kİ-MKH'lerin veya BMKH'lerin koruyucu etkileri in vitro modelde test edilememiştir. Sonuç olarak bu tez kapsamında: DSS kullanarak immün yetmezlikli olan Rag2 farelerinde İBH ve düşük doz BU kullanılarak HLA uyumsuz, aktive edilmiş B6 dalak T hücrelerinin infüzyonu ile Rag2 farelerinde intestinal aGvHD benzeri bir model geliştirilmiştir. Bağırsak hasarının makroskobik ve mikroskobik değerlendirmesine dayanılarak, mevcut skorlama sistemlerini modifiye edilerek optimize edilmiştir. Rag2 fare kolonoidler geliştirilmiştir ve aktive edilmiş B6 dalak T hücreleriyle birlikte ko-kültür edilerek bir intestinal aGvHD in vitro modeli geliştirilmiştir. B-MKH'ler morfolojik, immünofenotipik, farklılaşma ve immünomodülatuvar kapasiteleri açısından KİMKH'lerle karşılaştırılıp hücrelerin birbirine büyük benzerlik gösterse de B-MKH'lerin immün modulatuvar etkilerinin in vitroda yaklaşık 3 kat daha az güçlu olduğu gösterilmiştir. Kİ-MKH infüzyonlarının DSS kaynaklı İBH'de ve B-MKH veya Kİ-MKH'lerin infüzyonlarının T hücresi kaynaklı aGvHD farelerinde bağırsakta hasarlı bölgelere doğru göç etme kapasiteleri ve bağırsak hasarı semptomları üzerindeki etkilerinin büyük benzerlik gösterdiği kanıtlanmıştır.
Özet (Çeviri)
Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation is the only curative treatment option for a number of hematological diseases, whether they are malignant or non-malignant. Graft versus host disease (GvHD) occurs after allo-HSCT due to a generalized response of donor-derived T cells to human leukocyte antigen HLA proteins on the surface of recipient cells. Preclinical studies aimed at a better understanding of the pathophysiology of aGvHD require the use of many mice and result in considerable discomfort in the mice and may even lead to death. Therefore, in the framework of this thesis, we aimed to develop alternative intestinal aGvHD models that would induce less harm, while still functioning as a representative disease model. In order to be able to assess the clinical effects of our model, we generated a mouse model of Inflammatory Bowel Disease (IBD) using DSS treatment of immunodeficient Balb/c-Rag2-/- (Rag2) mice to develop a general scoring system for intestinal damage. We then developed an in vivo and in vitro model of intestinal aGvHD using a low intensity BU-based conditioning regimen in Rag2 mice and Rag2 derived colonoids, respectively. Using these models, we tested the effects of bone marrow and intestinal mesenchymal stromal/stem cells on aGvHD severity, and assessed their migratory, immune modulatory and regenerative potential. We found that the use of the Rag2 intestinal aGvHD model offers a great advantage in studying intestinal damage in the absence of overt other tissue involvement, requiring less animals for use. In addition, the in vitro aGvHD-in-a-dish model of can be used to model intestinal aGvHD and shows great similarity to the in vivo model.
Benzer Tezler
- Development of mirna biomarkers for the differentiation between gingivitis and periodontitis: A pilot study
Gingivitis ve periodontitis ayrımı için mirna biyobelirteçlerinin geliştirilmesi: Pilot çalışma
DHAFIR LATIEF FAYADH FAYADH
Doktora
İngilizce
2023
BiyokimyaSüleyman Demirel ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MUSTAFA CALAPOĞLU
- Wistar tipi erkek farelerin gastrointestinal kanal duvarında yaygın apud hücrelerinin türleriyle dağılımlarının modifiye gümüşleme metodlarıyla ışık mikroskobu düzeyinde incelenmesi
Başlık çevirisi yok
MEVLÜT ASAR
Doktora
Türkçe
1986
MorfolojiAkdeniz ÜniversitesiHistoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MERAL TEKELİOĞLU
- İzmir'in çeşitli semtlerinde satılan çiğ sütlerde total bakteri, stafilokok sayımı ve tipleri
Başlık çevirisi yok
NECLA ÇAĞLARIRMAK
Yüksek Lisans
Türkçe
1987
MikrobiyolojiDokuz Eylül ÜniversitesiMikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. HAKKI BAHAR
- İlk defa sentez edilen monohidroksi tetradekanoik asidler ile yapılan trigliseridlerin in vivo ve in vitro olarak lipaz ile etkileşimi
Başlık çevirisi yok
REFİYE YANARDAĞ
- Ratlarda massif ince barsak rezeksiyonu sonrası oluşan hiperasiditeye trunkal vagotominin etkileri
Başlık çevirisi yok
SALİH Z. PİŞKİN