Optimization of conventional and CRISPR-dcas9-based overexpression systems against root-knot nematodes in tomato
Domateste kök-ur nematodlarına karşı geleneksel ve CRISPR-dcas9 tabanlı aşırı ifade sistemleri optı̇mı̇zasyonu
- Tez No: 855306
- Danışmanlar: DOÇ. DR. MUSA KAVAS
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2024
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Ondokuz Mayıs Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Bitki paraziti nematodlar (PPN'ler) dünya çapında çeşitli bitkiler ve mahsuller için önemli bir ekonomik zorluk teşkil etmektedir. Bitkiler, nematod üremesini engellemede ve M. incognita'nın verdiği zararı en aza indirmede kritik öneme sahip olan, topluca bitki kök eksüdası olarak adlandırılan, suda çözünen ve uçucu organik bileşiklerin (VOC) çeşitli bir kombinasyonunu toprağa salmaktadır. Çalışmamız, köke özgü promotörler (SIRPL11) altında geleneksel aşırı ekspresyon ve CRISPR-ACT3.0 teknolojisini kullanarak Domates bitkisinin köklerinde palmitik asit ve türevlerinin sentezlenmesinden sorumlu çoklu endojen genlerin (FATA, FATB1, FATB2 ve FATB3) ekspresyonunu artırmaya odaklanmaktadır. Geleneksel aşırı ekspresyon yaklaşımında, yabani tipe kıyasla gen ifadesinin ve palmitik asit içeriğinin yukarı regülasyonu gözlenmiştir. Sonuç olarak, bu çalışmada değerlendirilen hatlar arasında M. incognita'nın üreme indeksindeki (% RI) azalma % 6,5 ila % 71,4 arasında değişmiştir. Geleneksel aşırı ekspresyonun dezavantajı nedeniyle CRISPR-Act3.0 da kullandık. Genlerin aktivasyon etkinliğini sağlamak için, bu durumda her bir genin promotör bölgesini hedeflemek üzere iki tek kılavuz RNA (sgRNA) kullanılmıştır. Bundan sonra, daha kapsamlı bir gen aktivasyon yaklaşımı için çoklu sgRNA kaseti tek bir vektörde birleştirilir. CRISPR-Act3.0 vektörlerinin aktivasyon etkinliğini ve hızlı değerlendirmesini belirlemek için, in vitro Agrobacterium rhizogenes aracılı saçak kök transformasyonu (HRT) Domates'te optimize edilmiştir. A. rhizogenes suşu, birlikte yetiştirme süresi, Domates genotipi ve eksplant tipi dahil olmak üzere farklı parametreler değerlendirilmiştir. Genlerimizin en yüksek transformasyonu, 10 günlük hipokotil ve kotiledon cv. Bobcat'in 3 ve 4 gün boyunca aşılanmış hipokotil ve kotiledonlarında gözlenmiştir. İki hafta sonra, köklerin hipokotilden büyümeye başladığını fark ettik, oysa 4 haftadan daha uzun bir süre sonra kotiledonlardan tüylü kökler gözlemledik. CRISPR-Act3.0 sisteminin genlerimizi aktive etmedeki etkinliği yaklaşık 2,5 ila 18 kat arasındaydı. Bulgularımız, CRISPR-Act3.0 sistemlerinin multipleks gen aktivasyonunu sağlamadaki etkinliğine dair kanıtlar sunmakta ve böylece ekonomik açıdan önemli olan bu türde transkripsiyonel aktivasyonun uygulanabilirliğini artırmaktadır.
Özet (Çeviri)
Plant-parasitic nematodes (PPNs) pose a considerable economic challenge for various plants and crops worldwide. Plants release a diverse combination of water-soluble and volatile organic compounds (VOCs) into the soil, collectively referred to as plant root exudate, which is critical in inhibiting nematode reproduction and minimizing the damage inflicted by M. incognita. Our study focuses on increasing the expression of multiple endogenous genes (FATA, FATB1, FATB2, and FATB3) responsible for synthesizing palmitic acid and its derivatives in the roots of the Tomato plant by using traditional over-expression and CRISPR-ACT3.0 technology under root-specific promoters (SIRPL11). In the traditional overexpression approach, the upregulation of gene expression and palmitic acid content was observed compared to the wild type. As a result, the reduction in the reproduction index (RI%) of M. incognita across the evaluated lines in this study varied from 6.5% to 71.4%. Because of the disadvantage of traditional over-expression we have used CRISPR-Act3.0 also. To ensure the activation efficiency of the genes, two single guide RNAs (sgRNAs), in this case, are employed to target the promoter region of each gene. After that assembling the multi-sgRNA cassette into one vector for a more comprehensive gene activation approach. For determining the activation efficiency and rapid assessment of CRISPR-Act3.0 vectors, in vitro Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root transformation (HRT) was optimized in Tomato. Different parameters were evaluated, including A. rhizogenes strain, co-cultivation period, Tomato genotype, and explant type. The highest transformation of our genes was observed on 10-d-old hypocotyl and cotyledon of cv. Bobcat inoculated for 3 and 4 days. After two weeks, we noticed that the roots started to grow from the hypocotyl, whereas we observed hairy roots from cotyledons after more than 4 weeks. The effectiveness of the CRISPR-Act3.0 system in activating our genes was about 2.5- to 18-fold. Our findings provide evidence for the efficacy of CRISPR-Act3.0 systems in enabling multiplex gene activation, thereby enhancing the feasibility of implementing transcriptional activation in this economically significant species.
Benzer Tezler
- Terapötik monoklonal antikor üretiminin optimizasyonu ve veriminin arttırılması
Optimization and increasing efficiency of production of therapeutic monoclonal antibodies
BURCU NUR AYDIN
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
Mikrobiyolojiİstanbul Üniversitesi-CerrahpaşaTıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ARİF KAYGUSUZ
PROF. DR. MEHMET ZİYA DOYMAZ
- Farklı mof esaslı ilaç taşıyıcı sistemlerin sentezi, karakterizasyonu ve anti kanser etkinliğinin incelenmesi
Synthesis, characterization, and investigation of the anticancer activity of different mof-based drug delivery systems
MAHSA HEIDARNEJAD
- Engineering of probiotic Saccharomyces boulardii as a host for living therapeutic applications
Probiyotik Saccharomyces boulardii'nin yaşayan terapötik uygulamalarında konak olarak kullanılmak üzere geliştirilmesi
ORHAN NEDİM KURT
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
Mikrobiyolojiİhsan Doğramacı Bilkent ÜniversitesiMalzeme Bilimi ve Nanoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
DOÇ. DR. URARTU ÖZGÜR ŞAFAK ŞEKER
- Hibrit bulanık sinir ağını kullanarak bir sınıflandırma ve kural çıkarma sisteminin geliştirilmesi
Developing a classification and rule extraction systems using hybrid fuzzy neural network
HUMAR KAHRAMANLI
- Self-tuning structures of interval Type-2 fuzzy PID controllers
Aralık değerli Tip-2 bulanık PID kontrolörler için öz-ayarlama yapıları
AHMET SAKALLI
Yüksek Lisans
İngilizce
2014
Bilgisayar Mühendisliği Bilimleri-Bilgisayar ve Kontrolİstanbul Teknik ÜniversitesiKontrol ve Otomasyon Mühendisliği Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ENGİN YEŞİL