Geri Dön

Expression, purification and characterization of high-fidelity DNA polymerase

Yüksek-duyarlı DNA polimeraz enziminin üretilmesi, saflaştırılması ve karakterizasyonu

PDF İndir

  1. Tez No: 783309
  2. Yazar: KÜBRA TÜRK
  3. Danışmanlar: PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Biyoteknoloji, Polimeraz zincirleme reaksiyonu, Protein saflaştırma, Biotechnology, Polymerase chain reaction, Protein purification
  7. Yıl: 2022
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

DNA polimerazlar günümüze dek keşfedilen bütün canlı hücrelerde bulunan, şablon DNA'ya komplementer yeni bir DNA zinciri sentezlenmesinde görevli bir enzimdir. Bu enzim, hücre bölünmesi sırasında genetik bilginin nesiller boyunca taşınmasında büyük bir rol oynarken, günümüz in-vitro tanı tekniklerinin en önemlilerinden olan Polimeraz Zincir Reaksiyonu'nun (PZR) da temelini oluşturmaktadır. PZR, uzun zaman önce ortaya çıkmış ve biyoteknolojinin temel tekniklerinden biri olarak yerini almıştır. DNA polimerazlar, türler arasında korunan bir deoksiribonükleotit zincirini sentezleme yeteneğinin yanı sıra işlenebilirlik, aslına uygunluk (sentez doğruluğu) ve nükleotit seçiciliği gibi yeteneklere de sahip olabilirler. Bu yeteneklerine göre bazı polimerazlar, yüksek hata oranına sahip olmalarından kaynaklı, rastgele mutasyonlar gerçekleştirmek amacıyla kullanılırken, bazıları ise çok düşük hata oranına sahip olup, şimdiye kadar gerçekleştirilen en büyük çalışmalardan biri olan İnsan Genom Projesi gibi araştırmalarda kalıp DNA'yı olabilecek en düşük hata oranıyla çoğaltmak için kullanılır. PZR temelli çalışmalarda kullanılan enzimlerin stabilitesinin, sıcaklığa bağlı olarak azalmaması yüksek önem arz ettiğinden çoğunlukla termostabil DNA polimeraz enzimleri tercih edilmektedir. Termostabil DNA polimerazlar arasında ilk keşfedilen ve en ünlü olanı Thermus aquaticus'tan izole edilen Taq DNA polimerazıdır. Taq polimerazı takiben hipertermofilik arkelerden elde edilen DNA polimerazlar da PZR çalışmalarında kullanılmaya başlanmıştır. Yüksek duyarlı DNA polimeraz da 1991 yılında keşfedilen ve yüksek termofilik özellik gösteren bir DNA polimerazdır. Klonlama gibi yüksek doğruluk gerektiren uygulamalarda düzeltme aktivitesine (proofreading) sahip yüksek duyarlı DNA polimeraz gibi DNA polimerazlar yaygın olarak kullanılmaktadır. Yüksek duyarlı DNA polimeraz, 775 amino asit uzunluğunda, yaklaşık 90 kDa moleküler ağırlığa sahip bir enzimdir. Bu enzim, DNA sentezi sırasında yapıya eklenen yanlış nükleotidlerin yapıdan çıkarılarak doğrusunun eklenmesini sağlayan 3'-5' düzeltme okuması gerçekleştirebilmektedir. Bu özelliği sayesinde sentez sırasındaki hata oranını azaltmaktadır (1.3×10-6 mutasyon/baz çifti/duplikasyon). Bu da Taq DNA polimeraz ile karşılaştırıldığında yaklaşık 8 kat daha az hata yaptığını gösterir. Birçok araştırmacı, bu proteini hipertemofilik bir arke olan Pyrococcus furiosus'tan Escherichia coli'nin farklı suşlarına klonlayarak üretimini gerçekleştirmiştir. Proteinin biyofiziksel özellikleri ve klonlama sırasında eklenen afinite etiketlerinden yola çıkarak ise afinite kromatografisi veya iyon değişim kromatografisi ile saflaştırma protokolleri oluşturulmuştur. Bu çalışmada yüksek duyarlı DNA polimeraz enziminin yüksek verimle, düşük maliyetli bakteriyel üretiminin ardından termal stabilitesi ve 10X Polihistidin etiketinden yararlanılarak saflaştırılması ve karakterizasyonunun yapılması amaçlanmıştır. Çalışmada, ticari olarak satın alınan N-ucunda 10X Polihistidin etiketi bulunan pET16B plazmit DNA kullanılmıştır. pET16B plazmiti, GroEL/GroES şaperoninlerini içeren kompetent E. coli BL21(DE3) hücrelerine transforme edilerek proteinin ifadesi sağlanmıştır. Termostabil bir protein olan yüksek duyarlı DNA polimeraz'ın saflaştırmasının ilk adımında, bakteri hücrelerinden katlanmış formda elde edilen tüm proteinler ısıtılmış ve santrifüjlenerek termal stabilitesi daha az olan safsızlıklar ayrılmıştır. Çözünür formda olan yüksek duyarlı DNA Polimerazı IMAC afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırılmıştır. Saf ürün, filtrasyon işlemi uygulanarak %50 oranında gliserol içeren saklama tamponuna alınmıştır. GroEL/GroES şaperonin sistemi, 2-100 kDa moleküler ağırlığa sahip katlı olmayan proteinlerin in-vitro ve in-vivoda katlanabilmesini sağlayan bir sistemdir. Farklı boyutlardaki proteinlerin katlanmasını %70 oranına kadar artırabildiği görülmüştür. Protein üretimi için yüksek verim sağlayabileceği düşünüldüğünden yüksek duyarlı DNA polimeraz'ın üretiminde bu sistem kullanılmıştır. Fakat bu sistem hedef proteinin miktarını artırırken, safsızlıkların da miktarını artırabilmektedir. Bu nedenle yüksek miktarda üretimi gerçekleştirilen enzimin saflaştırma aşaması oldukça gayret gerektirdi. Lac operonu tarafından yönetilen, hedef enzimi kodlayan genin ifadesi için IPTG kullanılarak sistem indüklenmiş, hücrelerin büyüme sıcaklığı 18°C'ye düşürülerek inklüzyon cisimciklerinin stabiliteleri bozulmuştur. Hücrenin metabolizma hızının ve dolayısıyla büyüme hızının yavaşladığı 12-20°C aralığındaki sıcaklık seçildiğinden, şaperonlar tarafından katlanmış protein miktarının artması sağlanmıştır. Hedef proteinle birlikte ortamda miktar olarak artış gösteren safsızlıkların büyük çoğunluğu, proteinlerin sıcaklık ile muamelesiyle elimine edilmiştir. Sıcaklığa dayanıklı olmayan hücresel proteinler ortamdan ayrılabilirken, sıcaklığa dayanıklı olduğu bilinen yüksek duyarlı DNA polimeraz enzimi, GroEL ve GroES proteinleri hala ortamdadır. GroEL ve GroES'nin ortamdan ayrılabilmesi adına IMAC afinite kromatografisi uygulanarak enzimin saflığı artırılmıştır. Saflaştırma sonuçları SDS-PAGE ve immünoblotlama ile analiz edilmiştir. Üç biyolojik tekrarlı 500 ml'lik bakteriyel üretim ve buradan elde edilen proteinlerin saflaştırılması sonucunda ~%90 saflığa sahip toplamda 60 000 PZR reaksiyonu için kullanılabilecek yeterlilikte, ticari muadilleri ile benzer kalitede yüksek duyarlı DNA Polimeraz enzimi üretilmiştir. Proteinin kalite testleri SDS-PAGE, immünoblotlama, peptit haritalama, Dairesel Dikroizm (CD); fonksiyon testleri PZR ile; kalite kontrol testleri dondur-çöz stres deneyleri, oda sıcaklığında stabilite deneyleri, sıcaklığa bağlı erime deneyleri gibi testler ile tamamlanmıştır. Üretilen proteinin hedef protein olduğunun kanıtlanması amacıyla Sıvı Kromatografisi-Kütle Spekrometresi (LC-MS) cihazı kullanılarak peptit haritalama yapılmıştır. Bu analiz için üç biyolojik tekrarlı üretim ve saflaştırması gerçekleştirilen enzimler jele yüklenerek SDS-PAGE yapılmıştır. Jelde yürütülen peptitler çeşitli yıkama aşamalarının ardından tripsin ile kesilerek jelden alınmıştır. Analizlere göre saflaştırılan proteinlerin, hedef yüksek duyarlı DNA polimeraz enzimi olduğu sonucuna varılmıştır. Üst akım ve alt akım çalışmaları sonucunda elde edilen proteinin fonksiyonel olup olmadığının belirlenmesi amacıyla Dairesel Dikroizm (CD) kullanılarak %90 üzerinde saflığa sahip proteinin ikincil yapı analizi far-UV (<260 nm) aralığında gerçekleştirilmiştir. Çalışma sonucunda protein 208 ve 222 nm dalga boylarında iki negatif pik, 190 nm dalga boyunda pozitif pik vererek α-heliks özelliği göstermiştir. Katlı olduğu belirlenen proteinin fonksiyonel analizleri Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) gerçekleştirilerek tamamlanmıştır. PZR'de 825 bç uzunluğunda İnsan BCL2 geni ve 1947 bç uzunluğunda İnsan c-Raf geni kullanılmıştır. Bu genlerin içerdiği G-C oranı sırasıyla %49.6 ve %61'dir. Çoğaltılmak istenen hedef gen bölgesindeki G-C miktarı, enzimin işleyebilirliğini ve doğruluk oranını etkileyebildiğinden fonksiyon deneylerinde G-C oranı yüksek gen bölgeleri tercih edilmiştir. Ticari olarak satılan yüksek duyarlı DNA polimeraz enzimlerinin hedef gen bölgesini sorunsuz çoğaltabilmeleri için endonükleaz ve eksonükleaz kontaminasyonu bulunmamaktadır. Kalite kontrol deneyleri kapsamına iki farklı markaya ait enzim ile ürettiğimiz enzimin üç biyolojik tekrarı, endonükleaz ve eksonükleaz kontaminasyon testlerinde karşılaştırılmıştır. Bu test kapsamında enzimler, endonükleaz ve eksonükleaz kontaminasyonu olup olmadığının gösterilmesi amacıyla λ DNA (süper sarımlı DNA), HindIII enzimi ile kesilmiş λ DNA (λ DNA/HindIII) ile 37°C'de 4 saat inkübe edilmiştir. Deney sonucunda ticari enzimlerin ve bizim ürettiğimiz enzimin süper sarımlı DNA'yı çentikli DNA'ya dönüştürmediği, yani endonükleaz kontaminasyonu görülmediği; HindIII enzimi ile kesilen λ DNA'da ise pozitif kontrole göre yeni bantlar oluşmadığı, diğer deyişle enzimin eksonükleaz kontaminasyonu bulunmadığı sonucuna varılmıştır. Ticari enzimlerin kalitesinin gösterilmesi için bir diğer önemli test ise stabilite testleridir. Ürettiğimiz enzimin dayanıklılığını gösterebilmek adına 20 kez tekrarlanan dondur-çöz stres deneyleri ve oda sıcaklığında 5 gün boyunca yapılan inkübasyon deneyleri tamamlanmıştır. Bu deneyler sonucunda enzimlerin genel kullanımı sırasında yapılan dondurup çözülme işleminin, proteinin aktivitesinde negatif bir etkiye yol açmadığı; enzimlerin kullanım sırasında 5 güne kadar oda sıcaklığında unutulması durumunda aktivitesinde azalma olmadan kullanılmaya devam edilebileceği gösterilmiştir. Sonuç olarak, yaptığımız çalışmada ürün verimi geleneksel yöntemlerle üretilen proteinlere göre GroEL/GroES şaperoninleriyle üretilerek artırılmıştır. Seçilen üretim metodundan kaynaklı zorlaşan saflaştırma aşaması, sıcaklıkla muamele ve tek aşamalı IMAC afinite kromatografisi kullanılarak optimize edilmiştir. Ticari enzimlerle karşılaştırmalı olarak kurulan fonksiyonel deneyler ve stabilite deneyleri ise ürettiğimiz enzimlerin, ticari muadilleri ile benzer aktivite ve stabiliteye sahip olduğunu, sektörde önde gelen markaların ürünleri ile kıyaslanabilecek kalitede olduğunu göstermiştir. Tüm üretim ve saflaştırma aşamaları ölçek büyütme çalışmalarına uygun olup, gelecek planları arasında büyük ölçekte üretim ve saflaştırma yapılarak ürünün ticarileştirilmesi birinci sırada yer almaktadır. Dahası, mutasyonlar gerçekleştirilerek yüksek duyarlı DNA polimeraz enziminin birim zamandaki sentez hızı artırılacaktır.

Özet (Çeviri)

DNA polymerases found in all living cells discovered to date are the enzymes that synthesizes a new DNA strand complementary to template single stranded DNA. These enzymes do not only play a major role in the transmission of genetic information across generations during cell division, they also form the basis of Polymerase Chain Reaction (PCR), which is one of the most important in-vitro diagnostic techniques today. In addition to synthesis ability, DNA Polymerases may also have other properties including processivity, which is known as the ability of continuous polymerization, fidelity, which is known as the synthesis accuracy, and nucleotide selectivity. Thermostable DNA polymerase enzymes are mostly preferred in PCR-based studies because it is high importance that the stability of the enzymes used do not decrease depending on temperature. Taq DNA polymerase is the first discovered polymerase, which is a well-known enzyme used in a wide range of applications. Following the discovery of Taq DNA polymerase, the high-fidelity DNA polymerase was discovered in 1991 as a highly thermophilic DNA polymerase. Due to its high thermostability and proofreading properties, high-fidelity DNA polymerase is widely used in the applications that require high accuracy such as molecular cloning. High-fidelity DNA polymerase is an enzyme with a length of 775 amino acids and a molecular weight of about 90 kDa. This enzyme can perform 3'-5' exonuclease (proofreading) activity, which allows the addition of the correct nucleotides by removing the wrong nucleotides added to the structure during DNA synthesis. Due to this feature, it reduces the error rate during synthesis (1.3×10-6 mutations/base pairs/duplications), resulting in about 8 times less errors compared to Taq DNA polymerase. Many researchers have produced this protein by cloning it from Pyrococcus furiosus, a hyperthemophilic archaea, into different strains of Escherichia coli. The purification step is simplified by adding an affinity tag to the N- or C-terminus during the cloning. Based on these tags and various biophysical properties of the protein, purification protocols were created by affinity chromatography or ion exchange chromatography. In this study, we aimed to purify and characterize the high-fidelity DNA polymerase enzyme by taking the advantage of its thermal stability and 10X Polyhistidine-tag after bacterial production with high efficiency and low cost. For this purpose, commercially purchased pET16B. High-fidelity polymerase's plasmid DNA with a 10X Polyhistidine-tag at the N-terminus was used. The plasmid pET16B. High-fidelity polymerase was transformed into competent E. coli BL21(DE3) cells containing GroEL/GroES chaperonins to ensure soluble expression of the protein. In the first step of purification of High-fidelity DNA polymerase, which is a thermostable protein, all the folded proteins obtained from bacterial cells were heated and centrifuged to separate impurities with less thermal stability. High-fidelity DNA polymerase in soluble form was purified using IMAC affinity chromatography. The pure product was taken into a storage buffer containing 50% glycerol by filtration. The GroEL/GroES chaperonin system is a system that enables unfolded proteins with a molecular weight of 2-100 kDa to be folded in vitro and in vivo. Given that GroEL/GroES system can increase the folding of co-expressed recombinant proteins of different sizes by up to 70%, this system was employed in the production of High-fidelity DNA polymerase. However, while this system increases the amount of target protein, it can also increase the amount of impurities. Therefore, the purification of High-fidelity DNA polymerase was highly challenging. So that, various buffer compositions were used in order to optimize one step IMAC purification. Co-expression system was induced using IPTG for expression of pET16B. Expression of the polymerase regulated by the Lac operon. Since the growth temperature was chosen in the range of 12-20°C, where the metabolic rate of the cell and thus the growth rate was selected, the amount of protein folded by the chaperones was increased. Most of the impurities that increased with the target protein were eliminated with the 90°C heat treatment step. While heat sensitive proteins are eliminated from the environment, thermostable high-fidelity DNA polymerase enzyme, GroEL, and GroES proteins are still present. The separation of GroEL and GroES was achieved by applying IMAC affinity chromatography to increase the purity of the high-fidelity DNA polymerase enzyme. Purification results were analyzed by SDS-PAGE and immunoblotting methods. At the end of 500 ml bacterial production and purification process with three biological repetitions, high-fidelity DNA polymerase enzyme of similar quality with its commercial counterparts was produced, which can be used for a total of 60 000 PCR reactions with ~90% purity. The protein band on the SDS-PAGE gel was excised and analysed by peptide mapping using Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS) system to confirm that the produced protein is the target protein. According to the analysis, it was concluded that the purified protein was the target DNA polymerase. In order to determine if the purified protein is correctly folded or not, the secondary structure analysis of the protein with a purity over 90% was performed using Circular Dichroism (CD) in the far-UV (<260 nm) range. As a result of the study, the protein showed an apparent α-helix secondary structure with two minima at 208 and 222 nm wavelengths and a maximum at 190 nm wavelengths. Functional analysis of the protein on its folded state was completed by performing the Polymerase Chain Reaction (PCR). The 825 bp DNA region with 49.6% G-C content, and 1947 bp DNA region with 61% G-C content was amplified. These regions were selected considering the processivity of the enzyme. No-template control was used as negative control. The amplified regions were analyzed comparatively with commercial enzymes and it was observed that the target regions were successfully amplified. Commercially available high-fidelity DNA polymerase enzymes do not have endonuclease contamination and exonuclease contamination. Within the scope of quality control experiments, both endonuclease and exonuclease contamination of three biological replicates of our high-fidelity DNA polymerases were compared with commertial ones. λ DNA and λ DNA digested with HindIII were used as positive control. As a result, it has been shown that commercial enzymes and our high-fidelity DNA polymerase enzyme do not have endonuclease and exonuclease contamination. Another important test for demonstrating the quality of commercial enzymes is testing whether the protein remains stable under different conditions. For testing the stability of the polymerase, the effect of freeze-thaw stress repeated 20 times and also the effect of incubation of the enzyme for 5 days at room temperature were evaluated. As a result of these experiments, it has been shown that the freeze-thaw process during the general use of purified enzyme does not cause a negative effect on the activity of the protein, and that if the purified enzyme is forgotten at room temperature for up to 5 days during use, they can polymerize without reducing their activity. In conclusion, with this study, we have produced high-fidelity DNA polymerase with the same stability and processivity as commercial polymerases produced by large biotechnology companies with high efficiency and purity.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    255339

    High-level expression of hepatitis B surface antigen in Pichia pastoris, its purification and immunological characterization

    Hepatit B yüzey antijeninin Pichia pastoris'de yüksek miktarda expresyonu, saflaştırılması ve immunolojik karakterizasyonu

    HANDE SELAMOĞLU

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2009

    BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. GÜLAY ÖZCENGİZ

    PROF. DR. H. AVNİ ÖKTEM

  2. Tez No

    637756

    Recombinant expression, purification and characterization of TNFR1

    TNFR1'in rekombinant üretimi, saflaştırılması ve karakterizasyonu

    YAĞMUR ÖZ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2020

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)

    PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY

  3. Tez No

    737961

    Expression, purification, and characterization of soluble recombinant TNFR1

    Çözünür rekombinant TNFR1'in üretimi, saflaştırılması ve karakterizasyonu

    DERYA HATİPOĞLU

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)

    PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY

  4. Tez No

    713928

    Expression, purification, and characterization of recombinant human IL-2

    Rekombinant insan IL-2'nin ekspresyonu, saflaştırılması ve karakterizasyonu

    BUSE AKGÜN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)

    PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY

  5. Tez No

    608840

    Nokta mutasyonu yöntemi ile unag proteini varyantının (R112m/R132m) üretilmesi saflaştırılması ve karakterizasyonu

    Expression, purification and characterization of unag protein variant (R112m / R132m) by site directed mutagenesis

    RAMAZAN BAYAT

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2019

    BiyoteknolojiKaramanoğlu Mehmetbey Üniversitesi

    Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ YAKUP ULUSU

Geri Dön