Geri Dön

PCR based, isolation, cloning on expression of streptokinase gene from a group c streptococcus equisimilis in e.coli

Bir grup c (Streptocossus equisimilis)'e ait olan streptokinaz genin pcr-aracılığı ile izolasyonu, klonlaması ve e.coli'de ifade edilmesi

  1. Tez No: 76075
  2. Yazar: FARZİN ROOHVAND
  3. Danışmanlar: PROF. DR. UFUK GÜNDÜZ
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Escherichia coli, Streptococcus, Streptokinaz, Yalıtım, Escherichia coli, Streptococcus, Streptokinase, Insulation
  7. Yıl: 1998
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

Patojenik P-hemolitic streptococci grupları tarafından A, C ve G doğal olarak salgılanan ve bir plasminojen aktivatorü olan streptokinaz (SK), 30 yıldan beri bir klinik trombolitik ajanı olarak geniş bir şekilde kullanılmaktadır. SK'nin normal üretimindeki verim düşüklüğü ve konaktaki patogenisitesi, SK'nin bir rekombinant kaynağının araştırılmasının başlıca nedenidir. Bu tezde PCR metodu kullanılarak genomik templeytinin (template) hazırlanması için yeni bir yaklaşım getirilerek streptokinaz genin (skc) yüksek düzeyde spesifik ve çoğaltılmış parçasının izolasyonu açıklanmıştır. Bu yaklaşım, başlıca dış Pst I bölgelerin skc'nin komşu bölgelerinde (flanking regions) korunmasına dayanmaktadır. Tezde ayrıca, uygulanabilir geniş ifade edilme sistemlerinelde edilmesinde SK genlerin artırılması için 3 primer çiftinin uygulanması açıklanmıştır. Daha sonra vektördeki PCR ürünlerinin klonlanması, kompetent E. coli hücrelerinin transformasyonu, izolasyonu ve sınırlanmış harita analizi ve her iki DNA zincirinin dizilmesi ile uygun yapıların hazırlanması ve çalışmada E. coli'de skc'nin klonlanmasında karşılaşılan zorluklara değinilmiştir. Çalışmada daha sonra uygun konaklarda aktif rekombinant SK senteziyle sonuçlanan iki tip ifade edilme sisteminin yapısı açıklanmıştır. Bu sistemlerden birincisi lac Z'ye göre skc'nin pUC18 inframe içerisinde yerleştirilmiş bir açık okuma frame (open reading frame) vektörüdür. Böylece IPTG'nin indüklenmesi sonucu SK-pozitif fenotip gösteren, birleşik proteini elde edilmektedir. İkinci tip rekombinant ifade edilme vektörü, ısı indüklemesi sonucu E. coli'deki SK üretimini yönlendiren ve bakteriyofaj APr promoter ve Shine-Dalgarno dizilerinin (sequences) kontrolünde s&c'nin yerleştirilmesiyle ortaya çıkan yapıdan oluşmaktadır. Sonuçta ürünlerin özellikleri, arena düzeyinde Northern Dot Blotting ve protein düzeyinde SDS-PAGE, Western Blot ve kazein/plasminojen yöntemleriyle açıklanmaktadır. Bu çalışmada ısı aracığıyla ifade sistemlerinin düşük maliyetli ve güvenilir rekombinant sk'ların üretiminde başarıyla kullanılabileceği ve buna ilavaten SK proteinin NH2 terminal bölgesi değiştirilse bile hala aktif protein elde edilebileceği varsayımı doğrulanmaktadır. Ayrıca, skc'nin pUC19'da yerleştirilmesiyle ilginç bir alfa- komplimantasyon oluşması sonucu, skc'nin anti-N-terminal bölgesinde translasyon başlangıç bölgesini belirledik.

Özet (Çeviri)

Streptokinase (SK), a plasminogen activator which is naturally secreted by pathogenic, p-hemolytic groups A, C and G streptococci, is widely used clinically as a thromblytic agent for almost three decades. The low yield obtained in normal SK production and the pathogenicity of its host are the principal reasons to search for a recombinant source of SK. In this thesis, a new approach for prepartion of genomic template will be described to isolate the streptokinase gene (skc) as an extremly specific amplified fragment via PCR method. This approach is principally based on theconservation of the external Pst I sites in the flanking region of skc. The thesis will also describe, application of three pair of primers for amplification of SK gene, providing a broad range of expression systems applicable. Subsequently, cloning of the PCR products in the vectors, transformation of competent E.coli cells, isolation and preparation of the proper constructs by restriction map analysis, sequencing of both DNA strands and results of our study about difficulties encountered in cloning of skc in E.coli will be discussed. This study will then explain construction of two types of expression systems, which in appropriate hosts, results in synthesis of active recombinant SK (r-SK). The first is an open reading frame (ORF) vector in which skc is inserted into pUC18 inframe with respect to lac Z\ thus providing a fusion protein (Lac- SK) that confers a SK-positive phenotype as a result of induction by IPTG. The second type of recombinant expression vector is constructed by placing the SK gene under the control of bacteriophage XPr promoter and Shine-Dalgarno sequences in tandem, which directs production of SK in E.coli upon heat induction. Finally, characterization of the products at the RNA level by Northern Dot Blotting and at the protein level by SDS- PAGE, Western Blot and casein/plasminogen assay will be presented. This study ultimately concludes that heat-mediated expression systems may successfully be applied for the production of authentic lower price r-SK and further confirms the previous suggestions that active SK is obtained despite modifications in the NH2-terminal. In addition, we describe detection of a translation initiation region in the anti-N-terminal region of skc as a result of an interesting ct-complementation by insertion of skc in pUC19.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    82449

    PCR amplification, cloning and sequencing of the gene coding for salivaricin B and partial characterisation of the bacteriocin produced by Lactabacillus salivarius M7

    Başlık çevirisi yok

    OSMAN ÇATALOLUK

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    1999

    BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. CANDAN GÜRAKAN

  2. Tez No

    68436

    Amplification and isolation of a fragment of lactate dehydrogenase gene from rhizopus orgzae using RT_PCR

    RT-PCR metodu kullanılarak rhizopus orgzae'dan lactat dehidrogenaz geninin bir parçasının amplifikasyonu ve izolasyonu

    ERDOĞAN EŞREF HAKKI

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    1997

    Bilim ve TeknolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. MAHİNUR S. AKKAYA

  3. Tez No

    90969

    A Novel method for developing microsatellite markers and seuence analysis of wheat disease resistance gene analogs

    Yeni bir metodla mikrosatelit belirleyicilerinin geliştirilmesi ve buğdayda hastalığa dirençlilik geni analoglarının sekans analizi

    ERDOĞAN EŞREF HAKKI

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2000

    BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. MAHİNUR S. AKKAYA

    PROF. DR. AYKUT KENCE

  4. Tez No

    85665

    Japon bıldırcınlarında (coturnix coturnix japonica) DNA izolosyonu ve DNA parmakizlerinin çıkarılması

    DNA isolation and DNA fingerprintings of japanese quail (coturnix coturnix japanica)

    EMİNE DİLŞAT YEĞENOĞLU

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    1999

    ZiraatEge Üniversitesi

    Zootekni Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. GÜLDEHEN BİLGEN

  5. Tez No

    70065

    Tüberküloz tanısında standart kültür, hızlı kültür (MGIT) ve polimeraz zincir tepkimesi (PZT) yöntemlerinin karşılaştırılması

    Comparison of conventional solid culture, rapid culture (MGIT) and polymerase chain reaction (PCR) in the diagnosis of tuberculosis

    MEHTAP SONGUR

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    1998

    MikrobiyolojiDokuz Eylül Üniversitesi

    Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AYŞE YÜCE

Geri Dön