Geri Dön

Anoxybacillus ayderensis Ay9 ısıl kararlı β-Glukozidazının çift mutasyonu (G226Q/Y227F), karakterizasyonu ve bazı polifenolik substratların antioksidan kapasiteleri üzerine etkilerinin araştırılması

Double mutation (G226Q/Y227F) of Anoxybacillus ayderensis Ay9 thermal stable β-Glucosidase, characterization and investigation of the effects of some polyphenolic substrates on antioxidant capacities

PDF İndir

  1. Tez No: 750895
  2. Yazar: MİNE KARAOĞLAN
  3. Danışmanlar: PROF. DR. AHMET ADIGÜZEL
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Mikrobiyoloji, Biyoloji, Biyokimya, Microbiology, Biology, Biochemistry
  6. Anahtar Kelimeler: β-Glukosidazlar, polifenolik bileşikler, mutasyon, DPPH, Glükozidaz, Organik bileşikler, Polifenol, β-Glucosidases, polyphenolic compounds, mutation, DPPH, Glucosidase, Organic compounds, Polyphenol
  7. Yıl: 2022
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Atatürk Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

Amaç: β-Glukosidazlar, birçok polifenolik bileşiği de-glikosile edebilen glikozit hidrolazlar ailesinin önemli üyeleridir. Yapılan bu tez bu çalışmasının amacı, aktif yapısındaki amino asitlerin mutasyonları ile enzimin termostabilitesini ve doğal olarak oluşan ve ticari olarak satın alınan sentetik substratlara bağlı glukoz rezidülerinin seçici olarak uzaklaştırılmasını artırmak ve sonrasında polifenolik glikozitlerin antioksidan etkilerini artırıp enzimin endüstriyel alanlarda kullanımını kolaylaştırmaktır. Yöntem: Bgl Ay9 G226Q/Y227F mutant geni PCR temelli mutagenez yöntemi ile spesifik primerler kullanılarak oluşturuldu. PCR ürünü pGEMT klonlama vektörüne aktarıldı. .DNA dizisi Anoxybacillus ayderensis Ay9'un β-glukosidaz gen dizisi ile hizalandı ve pET28(+) ekpresiyon vektörüne aktarıldı. Protein ekspresyonu için rekombinant pET28(+) vektörü taşıyan E. coli BL21 hücreleri LB içerisinde büyütüldü. Enzim ekspresyonunu indüklemek amacıyla IPTG. Rekombinant protein, Ni2+ NTA afinite kromatografisiyle saflaştırıldı ve SDS PAGE'de görüntülendi. Enzimin biyokimyasal karakterizasyon işlemleri ve doğal substratların kinetik parametleri farklı yöntemler kullanılarak oluşturuldu. Enzimin polifenolik bileşikler üzerindeki antioksidan etkisi DPPH yöntemi kullanılarak test edildi. Bulgular: PCR temelli mutagenez yöntemi ile Bgl Ay9 G226Q/Y227F geni elde edildi. Enzimin ağırlığı SDS PAGE' de yaklaşık 54 KDa olarak tespit edildi. Enzimin optimum sıcaklığı 50°C ve optimum pH 'sı 6,0 olarak belirlendi.. Enzimin pNPG substratı ile oluşturulan Km, Vmax, değerleri sırasıyla 0,246 mM, 0,057 umol/dk, olarak belirlendi. Enzimin Polidatin, Mirisetin 3-O glikozit ve Kukurbitasin 2-E-O glikozit substratları üzerinde ki antioksidan etkisi sırasıyla %54,5 , %32,95 ve %41,2 olarak saptandı. Sonuç: Yabani tip(BglA9 WT) ve mutant Bgl Ay9 G226Q/Y227F enzimin karakterizasyon sonuçları karşılaştırıldı, mutantın optimum pH seviyesinin düştüğü (pH 8'den pH 6'ya) ve çözücüler, metallerle, deterjanlar ve glukoz etkileşimlerinde değişiklikler olduğu ve Optimum sıcaklığının, yabani tip ile uyumlu olduğu tespit edildi. Bunun yanında kinetik parametreler kıyaslandığında mutant enzimin bazı substratlara karşı ilgisinin azaldığı ve çalışma kapsamında belirlenen substratlar üzerindeki antioksidan etkisi arttığı tespit edildi.

Özet (Çeviri)

Purpose: β-Glucosidases are important members of the family of glycoside hydrolases capable of de-glycosylating many polyphenolic compounds. The aim of this thesis study is to increase the thermostability of the enzyme with the mutations of amino acids in its active structure and the selective removal of glucose residues due to naturally occurring and commercially purchased synthetic substrates, and then to increase the antioxidant effects of polyphenolic glycosides and facilitate the use of the enzyme in industrial areas. Method: Bgl Ay9 G226Q/Y227F mutant gene was generated by PCR-based mutagenesis method using specific primers. The PCR product was transferred into the pGEMT cloning vector. The DNA sequence was aligned with the β-glucosidase gene sequence of Anoxybacillus ayderensis Ay9 and transferred into the expression vector pET28(+). E. coli BL21 cells carrying the recombinant pET28(+) vector for protein expression were grown in LB. IPTG to induce enzyme expression. The recombinant protein was purified by Ni2+ NTA affinity chromatography and visualized on SDS PAGE. The biochemical characterization processes of the enzyme and the kinetic parameters of the natural substrates were created using different methods. The antioxidant effect of the enzyme on polyphenolic compounds was tested using the DPPH method. Findings: Bgl Ay9 G226Q/Y227F gene was obtained by PCR-based mutagenesis method. The weight of the enzyme was determined as approximately 54 KDa in SDS PAGE. The optimum temperature of the enzyme was determined as 50°C and the optimum pH was determined as 6.0. The Km, Vmax, values of the enzyme formed with the pNPG substrate were determined as 0.246 mM and 0.057 umol/min, respectively. The antioxidant effect of the enzyme on the substrates of Polydatin, Myricetin 3-O glycoside and Cucurbitacin 2-E-O glycoside was determined as 54.5%, 32.95% and 41.2%, respectively. Results: Characterization results of wild-type (BglA9 WT) and mutant Bgl Ay9 G226Q/Y227F enzyme were compared, showing that the mutant's optimum pH level decreased (from pH 8 to pH 6) and there were changes in interactions with solvents, metals, detergents and glucose. found to be compatible with In addition, when the kinetic parameters were compared, it was determined that the affinity of the mutant enzyme towards some substrates decreased and the antioxidant effect on the substrates determined within the scope of the study increased.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    139110

    Anoxybacillus gonensis'ten ısılkararlı bir alfa-amilazın karakterizasyonu

    Characterization of a thermostable alpha-amylase from Anoxybacillus gonensis

    İBRAHİM OMAROV

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2003

    KimyaKaradeniz Teknik Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. SAADETTİN GÜNER

  2. Tez No

    139111

    Yeni bir termofilik bakterinin, Anoxybacillus gonensis, polihidroksibutirat parçalama yeteneğinin incelenmesi

    Investigation of polyhydroxybutyrate degradation capabilities of a novel bacterium, Anoxybacillus gonensis

    DENİZ ŞİŞİK

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2003

    KimyaKaradeniz Teknik Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. SADETTİN GÜNER

  3. Tez No

    139245

    Gönen, Kestanbol ve Diyadin kaplıcalarından termofilik bakterilerin izolasyonu, moleküler yöntemlerle karakterizasyonu ve tanımlanması

    Isolation, characterization with molecular methods and description of thermophilic bacteria from Çönen, Kestanbol and Diyadin hot springs

    SABRİYE ÇANAKÇI DÜLGER

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2003

    BiyolojiKaradeniz Teknik Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ALİ OSMAN BELDÜZ

  4. Tez No

    146092

    Termofilik Anoxybacillus genensis G2 suşunun fruktoz-1,6-bisfosfat aldolaz geninin klonlanması, ekspresyonu ve karakterizasyonu

    Cloning, expression and characterization of the fructose-1,6-bisphosphate aldolase gene from thermophilic Anoxybacillus genensis G2 strain

    NAGİHAN SAĞLAM ERTUNGA

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2006

    KimyaKaradeniz Teknik Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    DOÇ.DR. AHMET ÇOLAK

  5. Tez No

    156155

    Anoxybacillus gonensis D-glukoz (D-ksiloz) izomeraz geninin klonlanması, izolasyonu ve karakterizasyonu

    Cloning, isolation and characterization of D-glucose (D-Xylose) isomerase gene from Anoxybacillus gonensis

    HAKAN KARAOĞLU

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2004

    BiyolojiKaradeniz Teknik Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ.DR. ALİ OSMAN BELDÜZ

Geri Dön