Bcr/abl füzyon proteininin k562 hücre serisinde in vitro olarak immunolojik metodla akım sitometride tayini ve sonuçların rt-pcr ile karşılaştırılması
In vitro detection of bcr/abl fusion protein immunologically with flow cytometry in k562 cell line and comparison of results with rt-pcr
- Tez No: 715973
- Danışmanlar: PROF. DR. HAKAN ÖZDOĞU
- Tez Türü: Tıpta Yan Dal Uzmanlık
- Konular: Hematoloji, Hematology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2013
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Başkent Üniversitesi
- Enstitü: Tıp Fakültesi
- Ana Bilim Dalı: İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Hematoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Kronik myeloid lösemi (KML) genellikle Philadelphia (Ph) kromozomu adı verilen özel bir kromozomal anormallik ile karakterize hematopoietik öncü hücrenin neoplastik dönüşümü ile ortaya çıkan klonal myeloproliferatif bir hastalıktır. Ph kromozomu 9. ve 22. kromozomlar üzerinde bulunan BCR ve ABL genlerinin translokasyonu ile meydana gelmektedir. KML hastalarında minimal kalıntılı hastalık takibi RT-PCR ile BCR/ABL mRNA'sının gösterilmesine dayanır. RT-PCR ile BCR/ABL onkogeninin gösterilmesi, çok fazla tekniğe dayalı ve teknisyen bağımlıdır. RT-PCR tekniklerindeki güçlükler ve standardizasyonundaki zorluklar nedeniyle KML hastalarının tanı ve takibinde yeni metodların geliştirilmesi ve kullanılması rutin pratikte önem arzetmektedir. Bu çalışmada K562 hücre hattında, BCR/ABL füzyon gen proteinin akım sitometri cihazı kullanılarak immunolojik boncuk yöntemiyle gösterilmesinin stanardizasyonu ve sonuçların altın standart olan moleküler yöntem ile karşılaştırılması amaçlanmıştır. Çalışma 2 koldan oluşturuldu. Birinci kolda K562 hücre hattında doğrusal olarak artan miktarlarda 9 farklı hücre grubu (1x103, 1x104, 5x104, 7.5x104, 1x105, 5x105, 1x106, 1.5x106, 2x106) kullanılarak RT-PCR ve akım sitometrik yöntemler istatistiksel olarak karşılaştırıldı. İkinci kolda ise, her bir grup için ayrı ayrı 1x107 K562 hücresi, 1 kontrol grubu ve 5 farklı dozda imatinib grubu ile 72 saat inkübe edildi. Sonrasında hücre canlılık analizleri yapıldı ve RT-PCR sonuçları ile akım sitometrik yöntem ile analiz sonuçları karşılaştırıldı. Çalışmanın 1. kolunda RT-PCR ile tüm hücre gruplarında BCR-ABL/ABL oranı pozitif olarak saptandı. Akım sitometrik yöntemler kullanıldığında hücre sayısı 1.000 ve 10.000 olan grupta BCR/ABL füzyon proteini tespit edilemedi, 50.000 ve üzerinde hücre sayılarının bulunduğu gruplarda BCR/ABL proteini pozitif bulundu (p<0,05). 50.000 hücre ve üzerindeki grupların akım sitometri sonuçlarının RT-PCR ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak özgüllük ve duyarlılığı %100 olarak bulundu. Çalışmanın 2. kolunda tüm gruplarda RT-PCR ve akım sitometri sonuçları pozitif bulundu. Canlılığın azaldığı gruplarda akım sitometrik yöntemler ile ortalama floresan yoğunluğun azaldığı (MFI) görüldü. Ancak RT-PCR ile BCR-ABL/ABL oranlarının, canlılık sonuçlarından etkilenmediği görüldü. Sonuç olarak, akım sitometrik yöntemler ile canlı ve 50.000 ve/veya üzerinde hücre ile çalışıldığında BCR/ABL füzyon proteini gösterilebilir.
Özet (Çeviri)
Chronic myeloid leukemia (CML) is a clonal myeloproliferative disease arising from a neoplastic transformation of hematopoietic progenitor cells, usually characterized with a specific chromosomal abnormality called Philadelphia (Ph) chromosome. Ph chromosome occurs with reciprocal translocation of BCR and ABL genes located on chromosomes 9 and 22, respectively. Follow up of minimal residual disease in CML patients is based on the detection of BCR/ABL mRNA by RT-PCR. Showing BCR/ABL oncogene by RT-PCR is a difficult and technician dependent method. Development and use of novel methods for diagnosis and follow up of CML patients are of importance in routine practice due to the difficulties in RT-PCR technique and its standardization. In this study, we aimed to standardize detection of BCR/ABL protein using a flow cytometric method in K562 cells, and to compare the results with the molecular method which is the gold standard. The study consisted of two arms. In the first arm, RT-PCR and flow cytometry methods were compared using nine different cell groups with gradually increasing amounts (1x103, 1x104, 5x104, 7.5x104, 1x105, 5x105, 1x106, 1.5x106, 2x106) in K562 cells. In the second arm, 1x107 K562 cells were incubated for 72 hours with each of the 6 groups (1 control group and 5 different concentration of imatinib applied groups). Afterwards, cell viability analysis was performed and the results of the RT-PCR and flow cytometric analyses were compared. While BCR-ABL/ABL ratio was found to be positive in all groups with RT-PCR in the first arm of the study, BCR/ABL fusion protein could not be detected by flow cytometry in groups with 1.000 and 10.000 cells. BCR/ABL protein was found to be positive in the groups that contain 50.000 or more cells (p<0.05). Specifity and sensitivity were 100% when flow cytometry results of the groups thatcontain 50.000 or more cells as compared with RT-PCR. RT-PCR and flow cytometry results were positive in all groups in the second arm. The mean fluorescence intensity was observed to decrease in flow cytometry methods in those groups with reduced viability. However, RT-PCR and BCR-ABL/ABL ratios were not affected by the viability. In conclusion, BCR/ABL fusion protein can be detected by using flow cytometry method, when a minimum of 50.000 viable cells are studied.
Benzer Tezler
- Dasatinib ile muamele edilen k562 hücre serisinde, dasatinib'in, pp2a katalitik ve regulatuvar alt birimlerinde, enzim aktivitesine ve protein ekspresyonu üzerine etkisinin değerlendirilmesi
The evaluation of the effects of dasatinib on protein expression and the enzymatic activity of PP2A catalytic and regulatory subunits that are dasatinib-treated k652 cell line
BUKET ÖZEL
Yüksek Lisans
Türkçe
2015
Tıbbi BiyolojiEge ÜniversitesiTıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. NUR SELVİ
- Kronik miyeloid lösemi tedavisinde ruxolitinibin in vitro uygulanması ile meydana gelen moleküler biyolojik değişikliklerin incelenmesi
Examination of molecular biologic changes that occur result of in-vitro application of ruxolitinib in chronic myeloid leukemia treatment
BAKİYE GÖKER
Yüksek Lisans
Türkçe
2015
Tıbbi BiyolojiEge ÜniversitesiTıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ÇIĞIR BİRAY AVCI
- İnsan kronik myeloblastik lösemi hücre dizisi K562'de imatinibin ve silimarinin BCR-ABL1, GRB2, GAB2, AKT ve ERK gen ifadelenmelerine olan etkisinin değerlendirilmesi
The evaluation of effect of imatinib and silimarin on BCR-ABL1, GRB2, GAB2, AKT and ERK gene expression levels in human myeloid leukemia cell line K562
BURCU YAZAR ÜNTEKİN
Yüksek Lisans
Türkçe
2014
Tıbbi BiyolojiBaşkent ÜniversitesiTıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ERKAN YURTCU
- İmatinib-dirençli lösemik hücrelerin atimik farelerde in vivo izlenmesi, histopatolojik analizi ve lösemik kök hücre belirteçleri açısından değerlendirilmesi
In- vivo tracking, histopathological analyses and leukemic stem cell markers assessment of imatinib-resistant leukemic cells in atimic mice
PELİN YALÇIN
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
Tıbbi BiyolojiDokuz Eylül ÜniversitesiTıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ZEYNEP YÜCE
- Ponatinib ve VS-5584 terapötik ajanlarının kronik miyeloid lösemi lökomogenezine etkileri
The effects of the therapeutic agents ponatinib and VS-5584 on chronic myeloid leukemia leukemogenesis
ÇAĞLA KAYABAŞI