İnfluenza A virüsü yüzey antijen proteini hemaglutininin mikroorganizmalarda çözünür halde üretilmesi
İnfluenza A virüsü yüzey antijen proteini hemaglutininin mikroorganizmalarda çözünür halde üretilmesi
- Tez No: 714486
- Danışmanlar: PROF. DR. KADİR TURAN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyokimya, Biyoloji, Genetik, Biochemistry, Biology, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Aşılama, Aşılar, Hemaglutinin, RNA, RNA virüsleri, Rekombinant protein üretimi, İnfluenza, İnfluenza A virüsü, İnfluenza aşısı, İnfluenza virüs, Vaccination, Vaccines, Hemaglutinin, RNA, RNA viruses, Recombinant protein production, Influenza, Influenza A virus, Influenza vaccine, Influenza virus
- Yıl: 2022
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Marmara Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyokimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
İnsanlarda grip salgınlarına neden olan influenza A virüsleri membranlı virüslerdir. Virüs membranında taşınan hemaglutinin (HA) ve nöraminidaz (NA) proteinleri bu virüslerin immün sistemde tanınmasında önemlidir. Bu nedenle inaktif saf virüs partikülleri veya saflaştırılmış HA ve NA proteinleri aşı çalışmalarında kullanılmaktadır. Çalışmamızda influenza A virüsü yüzey antijen proteinlerinden HA'nın Escherichia coli ve Pichia pastoris hücrelerinde rekombinant olarak çözünür halde üretilmesi amaçlandı. İnfluenza A/WSN/33 (H1N1) tipi virüsüne ait HA tam boyutta (HA0) veya HA1 domainini kodlayacak şekilde özgün oligonükleotid primerler kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonuyla (PZR) çoğaltılıp insan IgG1 antikorlarının sabit bölgelerini kodlayan diziyle kaynaşmış halde bir ara vektöre klonlandı. Kaynaşmış genler (HA0-Fc/HA1-Fc) ara vektör üzerinden PZR ile çoğaltılıp E. coli ve P. pastoris'te ekspresyon yapan vektörlere aktarıldı. Edinilen plazmit vektörler E. coli ve P. pastoris'e transforme edilip hücrelerin üreme profilleri belirlendi. Sonrasında hücrelerde sentezlenen rekombinant proteinler SDS-PAGE/Gümüş boyama teknikleriyle incelendi. E. coli hücrelerinde protein ekspresyonu için, HA0-Fc kontrolünde T7 promotörü (pET-14b-HA0-Fc/pET-14b-HA1-Fc) veya Lac promotörü (pLacI-HA0-Fc/pLacI-HA1-Fc) taşıyan plazmit vektörler oluşturulup transformasyon sonrası üreme profilleri incelendi. HA1-Fc kodlayan plazmit taşıyan bakterilerde bu protein yüksek seviyede üretilirken HA0-Fc füzyon protein ekspresyonu belirlenemedi. Maya hücreleri için oluşturulan pPinkα-HA0.Fc/pPinkα-HA1.Fc plazmitlerinin transformasyon sonrasında P. pastoris genomunda taşındığı PZR ile belirlendi ancak rekombinant proteinlerin ekspresyonu, SDS-PAGE/Gümüş boyama tekniğiyle saptanmadı. Edinilen veriler, influenza A virüsü membran proteini, HA proteininin bütün olarak E. coli hücrelerinde sentezinin konak için ileri düzeyde toksiktir. Dolayısıyla, bu proteinin rekombinant olarak üretilmesini dizginleyen ekspresyon sistemlerinin uygun olduğu anlaşıldı. Ayrıca çalışmada P. pastoris hücrelerinde HA proteini ekspresyonunda kullanılan sistem uygun değildir.
Özet (Çeviri)
Influenza A viruses that cause influenza epidemics in humans are membrane viruses. The hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) proteins carried on the virus membrane are important in the recognition of these viruses in the immune system. Therefore, inactivated pure virus particles or purified HA and NA proteins are used in vaccine studies. In our study, it was aimed to recombinantly produce soluble HA, one of the influenza A virus surface antigen proteins, in Escherichia coli and Pichia pastoris cells. The HA of influenza A/WSN/33 (H1N1) type virus was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using specific oligonucleotide primers encoding the full size (HA0) or HA1 domain, and fused with the sequence encoding the constant regions of human IgG1 antibodies into an intermediate vector was cloned. The fused genes (HA0-Fc/HA1-Fc) were amplified by PCR over the intermediate vector and transferred to vectors expressing E. coli and P. pastoris. Obtained plasmid vectors were transformed into E. coli and P. pastoris to determine the growth profiles of the cells. Afterward, recombinant proteins synthesized in cells were examined by SDS-PAGE/Silver staining techniques. For protein expression in E. coli cells, carrying T7 promoter (pET-14b-HA0-Fc/pET-14b-HA1-Fc) or Lac promoter (pLacI-HA0-Fc/pLacI-HA1-Fc) under HA0-Fc control plasmid vectors were created and growth profiles were examined after transformation. In bacteria carrying HA1-Fc coding plasmid, this protein was produced at high levels, but HA0.Fc fusion protein expression could not be determined. It was determined by PCR that the pPinkα-HA0.Fc/pPinkα-HA1.Fc plasmids created for yeast cells were transported in the P. pastoris genome after transformation, but the expression of recombinant proteins was not detected by SDS-PAGE/Silver staining technique. The obtained data indicate that the synthesis of the influenza A virus membrane protein, HA protein, in E. coli cells as a whole is highly toxic to the host. Thus, expression systems that restrain the recombinant production of this protein were found to be suitable. In addition, the system used in the expression of HA protein in P. pastoris cells is not suitable.
Benzer Tezler
- Targeting and activation of antigen specific CD8+ T cells with peptide-major histocompatibility complex I tetramers
Peptit-majör histokompatibilite kompleks I tetramerleri ile antijen spesifik CD8+ T hücrelerin hedeflenmesi ve aktivasyonu
ŞAFAK CEREN USLU ŞIVGIN
Doktora
İngilizce
2025
BiyoteknolojiHacettepe ÜniversitesiTemel Onkoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. HANDE CANPINAR
- Immunoreceptors modulate eosinophilic functions in viral immunity
Eozinofillerde viral bağışıklık yanıtının oluşumunda hücre zarına bağlı ve hücre içi reseptörlerin rollerinin araştırılması
LÜBEYNE DURMUŞ
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
DOÇ. DR. CEREN ÇIRACI
- İnfluenza virüsü yüzey antijen proteinlerinin mikroorganizmalarda rekombinant olarak üretilmesi ve analizi
Production and analysis of influenza virus surface antigen proteins in microorganisms
ŞEYMA ÖZAYDIN
- Viral yapıların tayininde kullanılmak üzere elektrokimyasal temelli biyosensör platformlarının geliştirilmesi
Development of electrochemical based biosensor platforms to be used in the determination of viral structures
RÜMEYSA EKİCİ
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
Mühendislik BilimleriBaşkent ÜniversitesiBiyomedikal Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. EMİR BAKİ DENKBAŞ
- İnfluenza virüs antijeni içeren çoklu (S/Y/S) emülsiyon formülasyonlarının geliştirilmesi, in vitro ve in vivo değerlendirilmesi
Development of multiple (W/O/W) emulsions containing influenza virus antigens, in vitro and in vivo evaluation
GÖKHAN HAYTA
Yüksek Lisans
Türkçe
2002
Eczacılık ve FarmakolojiAnkara ÜniversitesiFarmasötik Teknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ.DR. ASUMAN BOZKIR