Rekombinant DNA teknolojisi ile LF antijeni üretimi ve saflaştırılması
LF antigen production and purification with recombinant DNA technology
- Tez No: 649397
- Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ SONAY ÖZKAN, DR. DİĞDEM AKTOPRAKLIGİL AKSU
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Genetik, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Bacillus anthracis, DNA-rekombinant, Escherichia coli, Protein ekspresyonu, Protein saflaştırma, Bacillus anthracis, DNA-recombinant, Escherichia coli, Protein expression, Protein purification
- Yıl: 2020
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Gebze Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyokimya ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Bacillus anthracis toprakta uzun yıllar kalabilen sporlu bir bakteridir. Kutanöz, inhalasyon veya gastrointestinal yolla canlı organizmanın vücuduna girmesi ile şarbon hastalığına neden olan bir hastalıktır. Daha çok herbivorları (otçul canlıları) infekte etmektedir, ancak insanlara ve diğer memelilere de bulaşarak zoonotik enfeksiyonlara sebep olmaktadır. Temel virülans faktörleri, koruyucu antijen (PA), ödem faktörü (EF) letal faktör (LF) proteinlerinin şarbon toksisitesinde kilit rol oynadığı gösterilmiştir. Rekombinant DNA teknolojisi, modern biyoteknolojinin gelişimiyle hedef proteinin kolay ve verimli üretimi için olanak sağlamaktadır. Düşük maliyet yüksek saflıkta, çevre dostu üretim özellikleri ile ekonomik değeri oldukça yüksektir. B. anhtracis'e karşı geliştirilmiş AVA aşısı ve varyantlarının insan sağlığı üzerinde çeşitli yan etkiler oluşturmasından dolayı rekombinant olarak aşı üretilmesi hedeflenmiştir. LF proteinin ilaç, ile tanı kitlerinde antijen olarak kullanım alanları mevcuttur. LF proteininin rekombinant olarak E.coli vektörlerine klonlandıktan sonra üretilmesi hedeflenmiştir. Bu tez çalışmasında; lef geninin rekombinant olarak ticari E.coli taşıdığı çözünür protein seviyesindeki avantajı sebebiyle Rosetta 2(DE3) pLysS, XL1-Blue konak hücrelerinde üretim için tercih edilmiştir. Güncel plazmitlerden T7 promotörü sayesinde, hedef proteini yüksek verim ve doğrulukla üretilmesini sağlayan pET vektörleri ile çalışmalar sürdürülmüştür. Sentetik olarak E.coli ile uyumlu kodon optimize ve doğal yolla pXO1 plazmitinden PZR ile çoğaltılan gen blokları kullanılarak klonlanmış vektörler oluşturulmuştur. Sekanslama yoluyla ve PZR, SDS-PAGE ve Western blot analizi ile doğrulama çalışmaları yapılmıştır. Üretim miktarının indükleme miktarı IPTG, saate ve sıcaklığa bağlı ürün verimi üzerine çalışmalar tamamlanmıştır. AKTA Avant FPLC sistemi ile His-Trap kolonlarla His-Tag etiketleri ile saflaştırılma çalışmaları yapılmıştır. Elde edilen ürünlerin kimyasal kalıntılardan uzaklaştırılması, koşullara bağlı saklama çalışmaları ile tez kapsamı tamamlanmıştır.
Özet (Çeviri)
B.anhtracis is a spore forming bacteria that can be protected in the soil for many years. It causes anthrax disease through different means of entry like cutaneous, inhalation or gastrointestinal tract. It mostly infects herbivores, but can also infect humans and other mammals through what is called a zoonotic infection. The organism is known to produce Protective Antigens, Lethal Factor and Edema Factor proteins, which are the main virulence factors, have been found to play a key role in toxicity. Recombinant DNA technology provides the opportunity for easy and efficient production of the target protein with the development of modern biotechnology. Low cost, high purity and environmentally friendly production features are very high in economic value, Since the commercially available AVA vaccine and its variants developed against anthrax disease have various side effects on human health, this caused a shift of focus towards producing vaccines recombinantly. LF proteins as antigens in drug treatments, vaccine industry and diagnostic kits, by producing LF proteins recombinantly via cloned E.coli vectors. In this thesis study; Rosetta 2 (DE3) pLysS in XL1-Blue host cells were preferred for the method of production due to their advantage of possessing a lef gene recombinantly, in the level of soluble protein that commercial E.coli carries. Studies have been continued with pET vectors that produce the target protein with high efficiency and accuracy and T7 promoter from current plasmids. Synthetically codon-optimized version; compatible with E.coli, and naturally cloned vectors were generated from the pXO1 plasmid with the use of PZR. Confirmation studies were carried out through sequencing and by PCR, SDS-PAGE and Western blot analyses. Studies on product yield based on production quantity, induction quantity with IPTG concentration, time and temperature have been completed. Purification studies were carried out with the AKTA Avant FPLC system, with affinity His-Trap columns His-Tag cloned proteins. The scope of the thesis is completed with the removal of chemical residues from obtained products and with studies performed on varying conditional preservation techniques.
Benzer Tezler
- Rekombinant dna teknolojisi ile ef antijeni üretimi ve saflaştırılması
Production and purification of ef antigen with recombinant dna technology
MELİKE OYUNCAKÇI
Yüksek Lisans
Türkçe
2020
GenetikGebze Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. UYGAR HALİS TAZEBAY
DR. DİĞDEM AKTOPRAKLIGİL AKSU
- Rekombinant DNA teknolojisi ile antijen üretimi ve saflaştırılması
Antigen production and purification with recombinant DNA technology
MENEKŞE AKKÖSE
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
MikrobiyolojiGebze Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ASUMAN DEMİROĞLU ZERGEROĞLU
DR. DİĞDEM AKTOPRAKLIGİL AKSU
- Rekombinant DNA teknolojisi ile rekombinant bir antijene karşı antikor üretimi
Production of antibody against a recombinant antigen by using recombinant DNA techniques
IŞIN NERGİZ GEREN
Doktora
Türkçe
1999
Tıbbi BiyolojiMarmara ÜniversitesiTıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. BEYAZIT ÇIRAKOĞLU
- Rekombinant DNA teknolojisi ile Bacillus peptit feromonunun üretimi ve transformasyon etkinliğinin optimizasyonu
Production of Bacillus peptide pheromone with recombinant DNA technology and optimisation of transformation efficiency
DEVRİM DEMİR
Doktora
Türkçe
2004
Eczacılık ve FarmakolojiHacettepe ÜniversitesiFarmasötik Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. FİLİZ ÖNER
- Rekombinant DNA teknolojisi ile floresan protein üretimi
Fluorescent protein production with recombinant DNA technology
EBRU KABOĞLU
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
BiyomühendislikEge ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. GAYE ÖNGEN ÖZGEN
PROF. DR. SERAP EVRAN