Investigation of proteins associated with circadian rhythms using CRISPR-CAS9 technology and proximity labeling
CRISPR-CAS9 teknolojisi ve yakınlık etiketlendirmesi kullanılarak sirkadiyen ritim ile ilgili proteinlerin incelenmesi
- Tez No: 632234
- Danışmanlar: PROF. DR. NURİ ÖZTÜRK
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Genetik, Biyoteknoloji, Biology, Genetics, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2020
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Gebze Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Sirkadiyen saat fizyoloji ve metabolizmada günlük ritimler üretir. Moleküler düzeyde, sirkadiyen saat, CLOCK ve BMAL1 transkripsiyon faktörlerinin sirkadiyen saatçe-düzenlenen genleri (CCG'ler) aktive ettiği bir transkripsiyon-translasyon geri besleme döngüsü (TTFL) tarafından üretilir. CCG'nin iki ürünü (CRYPTOCHROME ve PERIOD) daha sonra CLOCK-BMAL1 aktivitesini inhibe eder ve bu aktivasyon/inhibisyon, transkriptomun %10-20'sinde salınım oluşturur. BMAL1 genini düzenleyen yeni proteinleri bulmayı amaçladık. Bu amaçla BMAL1'in düzenleyici bölgesindeki proteinleri etiketlemeyi ve bunları kütle spektrometrisi (MS) ile tanımlamayı planladık. Teknik olarak modifiye edilmiş bir peroksidaz olan APEX2 enzimine birleştirilmiş olan katalitik olarak ölü bir RNA kılavuzlu nükleaz Cas9 (dCas9)'dan oluşan CASPEX sisteminin BMAL1 promotorunun yakınındaki proteinlerin biyotinlenmesi sağlandıktan sonra bunların zengileşitirilmesini takiben MS analizi ile tanımlanmasını kullandık. CASPEX ve BMAL1 promotorunu hedefleyen iki farklı sgRNA, HEK293T hücrelerinde stabil olarak eksprese edildi. Hücreler daha sonra CASPEX ekspresyonunu indüklemek için doksisiklin ile muamele edildi ve yakınlığa bağlı biyotinlenmeye izin vermek için fenol biyotin hücre kültür ortamına ilave edildi. Biyotinlemeden sonra, etiketlenmiş proteinler streptavidin boncukları kullanılarak saflaştırıldı ve MS ile tanımlandı. Adaylar, hedefleme yapmayan bir sgRNA eksprese eden hücre hattında tanımlanan proteinlerin çıkarılması ile temizlendi. Özetle, BMAL1 geninin promotor bölgesinde yeni proteinler belirledik. MS analiz sonuçlarına göre, bir genin promotoru ve RNA polimeraz ile etkileşime girdiği bilinen transkripsiyon faktörleri (MED19, LCOR gibi) tanımlanmıştır. Bu sonuçlar CASPEX sisteminin yeni sirkadiyen saat regülatör proteinlerinin tanımlanmasında başarıyla kullanılabileceğini göstermektedir.
Özet (Çeviri)
The circadian clock generates daily rhythms in physiology and metabolism. At the molecular level, the circadian clock is generated by a transcription-translation feedback loop (TTFL) where CLOCK and BMAL1 transcription factors activate circadian clock-regulated genes (CCGs). The products of two of CCGs (CRYPTOCHROME and PERIOD) then inhibit CLOCK-BMAL1 activity and this activation/inhibition generates oscillations in 10-20% of transcriptome. We aimed at finding novel proteins that regulate BMAL1 gene. For this aim, we planned to label proteins in the regulatory region of BMAL1 and identify them by mass-spectrometry (MS). We used a catalytically-dead RNA-guided nuclease Cas9 (dCas9) fused to an engineered peroxidase APEX2 (CASPEX) to biotinylate proteins in the proximity of BMAL1 promoter for subsequent enrichment and identification by MS analysis. CASPEX and two different sgRNAs targeting BMAL1 promoter were stably expressed in HEK293T cells. Cells were then treated with doxycycline to induce the expression of CASPEX and phenol biotin was added into the medium to let proximity-dependent biotinylation to occur. After biotinylation, labeled proteins were purified using streptavidin-coated beads and identified by MS. The candidates were cleaned by excluding the proteins identified in a non-targeting sgRNA expressing cell line. In summary, we identified novel proteins in the promoter region of the BMAL1 gene. According to MS analysis results, transcription factors (such as MED19, LCOR) which are known to interact with the promoter of a gene and RNA polymerase were identified. These results show that the CASPEX system is effective for the identification of novel circadian clock regulatory proteins.
Benzer Tezler
- Pinealektomi ve eksojen melatoninin sıçanlarda α-naftiltiyoüre tarafından ı̇ndüklenen pulmoner ödem üzerine etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of pinealectomy and exogenous melatonin on pulmonary edema induced BY α-naphtylthiourea in RATS
MOHAMMED RAED ABDULLAH AL GBURI
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
BiyokimyaKarabük ÜniversitesiTıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ MEHMET DEMİR
- Kronik alkolik ratlarda serum mangan-SOD (Mn-SOD), çinko-bakır-SOD (Zn-Cu-SOD) ve nitrik oksit düzeylerinin incelenmesi
Investigation of serum manganase-superoxide dismutase (Mn-SOD), zinc-copper superoxide dismutase (Zn, Cu-SOD), and nitric oxide (NO) levels in chronic alcoholic rats
GONCA OTLU
- İnflamatuar belirteçler ile ambulatuar kan basıncı değişkenliği ve kan basıncı sirkadiyen değişimi arasındaki ilişkinin değerlendirilmesi
Assesment of the relationship between inflammatory markers and ambulatory blood pressure variability and blood pressure circadian variation
SÜLEYMAN ÖZBİÇER
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2008
KardiyolojiBaşkent ÜniversitesiKardiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MELEK ZEKİYE ULUÇAM
- SARS-COV-2 ile ilişkili hedef moleküllerin regülasyonunda ısı şok proteinlerinin rolünün araştırılması
Investigation of the role of heat shock proteins in the regulation of target molecules associated with SARS-COV-2
AYSEL ERİNMEZ
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
Tıbbi BiyolojiGaziantep ÜniversitesiTıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. EMEL ŞAHİN
- Kemik paget hastalığı ve frontotemporal demans ile gözlenen inklüzyon cisimcik miyopati hastalığıyla (IBMPFD) ilişkili bazı vcp mutant proteinlerin rekombinant DNA teknolojisi ile saflaştırılması ve in vitro bağlanma modellerinin incelenmesi
Purification of inclusion body myopathy with paget?s disease of the bone and frontotemporal dementia (IBMPFD) associated some VCP mutant proteins by recombinant dna technology and investigation of the in vitro binding patterns
YALÇIN ERZURUMLU
Yüksek Lisans
Türkçe
2013
Moleküler TıpEge ÜniversitesiBiyokimya Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. PETEK BALLAR KIRMIZIBAYRAK