Molecular cloning and production of recombinant hODF extracellular domain
Rekombinant hODF ekstrasellüler domain'in moleküler klonlanması ve üretimi
- Tez No: 547167
- Danışmanlar: YRD. DOÇ. DR. MUHAMMED KASIM DİRİL
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Tıbbi Biyoloji, Biyoloji, Biotechnology, Medical Biology, Biology
- Anahtar Kelimeler: Nükleer faktör-kappa B, Osteoklastlar, Rekombinant protein üretimi, Rekombinasyon-genetik, Reseptörler, Nuclear factor-kappa B, Osteoclasts, Recombinant protein production, Recombination-genetic, Receptors
- Yıl: 2019
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Dokuz Eylül Üniversitesi
- Enstitü: İzmir Uluslararası Biyotıp ve Genom Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
İnsan osteoklast değişim faktörü (hODF), osteoblastlar tarafından üretilen membrane proteinidir. Proteolitik olarak kesilmesiyle 143-317 amino asitlerden oluşan kesik-ekstraselüler domainini açığa çıkarır. hODF ekstraselüler domaini osteoclast membranındaki reseptörü olan RANK'e bağlanır ve aktive eder. Aktive edilmiş RANK, NF-KB'nin aktivasyonuna ve hücre çekirdeğine lokalize olmasına sebep olan hücre içi sinyal yolağını tetikler ve osteoklastogenik genlerin transkripsiyonuna sebep olur. Bu nihayetinde osteoklastların farklılaşmasını ve aktivasyonu ile sonuçlanır ki bu da kemikleri yeniden biçimleme yanıtıdır. Osteoklast oluşumunu in vivo ve in vitro olarak çalışabilmek için yeteri miktarda hODF proteinine ihtiyaç duyulur ki ilerki basamaklarda RAW264.7 osteoklast oluşum deneyinde ve in vitro bağlanma testlerinde kullanılabilsin. Bu yüzden biz rekombinant hODF ekstraselüler domainini ekspresyonuna ve saflaştırılmasına karar verdik. Rekombinant hODF, insan hücresinden elde edilen genomic DNAdan oluşturuldu ve moleküler klonlama yöntemleriyle birkaç ekspresyon vektörlerine klonlandı. Farklı saflaştırma statejilerinin denenmesi ve optimize edilmesinden sonra, GST tag edilmiş hODF bakterilerin içinde ekspres edilip glutatyon-agaroz boncuklarıyle saflaştırıldı. hODF, HRV3C proteazı ile boncuklardan ayırıldı ve sonuçlar SDS-PAGE ile analiz edildi. Geliştirdiğimiz protokol ile yaklaşık milligram miktarlarında ve %70 saflıktan daha fazla düzeyde hODF üretildi.
Özet (Çeviri)
Human osteoclast differentiation factor (hODF) is a membrane protein expressed by osteoblasts. Its proteolytic cleavage releases a truncated ecto-domain composed of its extracellular domain between amino acids 143-317. hODF extracellular domain, binds to and activates its receptor RANK on osteoclast membrane. Activated RANK triggers an intracellular signaling pathway which leads to activation and nuclear localization of NF-KB and transcription of osteoclastogenic genes. This eventually results in differentiation and activation of osteoclasts, eliciting a bone remodeling response. To study osteoclastogenesis in vivo and in vitro requires a significant amount of hODF protein which can be used in downstream experiments such as RAW264.7 osteoclastogenesis assay and in vitro binding assays. Therefore, we decided to express and purify recombinant hODF extracellular domain. Recombinant hODF DNA was generated from human cellular genomic DNA and cloned into several expression vectors by PCR based molecular cloning methods. After trial and optimization of different purification strategies, GST tagged hODF was expressed in bacterial cells and purified by glutathione–agarose beads. hODF was released from the beads by proteolytic cleavage by HRV3C protease and results were analyzed by SDS-PAGE. The protocol we developed enabled us to produce sub-milligram quantities of hODF with higher than %70 purity.
Benzer Tezler
- Nükleer rezonasta moleküler yapıların incelenmesi (yapısal faz geçiş kuramları üzerine bir inceleme)
Başlık çevirisi yok
ABDURRAHMAN ANDİÇ
Yüksek Lisans
Türkçe
1986
Fizik ve Fizik MühendisliğiUludağ ÜniversitesiFizik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AYTAÇ YALÇINER
- 1,3-difenil-4,5-bis(hidroksiimino)-imidazolidin ve Ni(II), Cu(II), Pd(II), UO2(VI) komplekslerinin sentezi
Başlık çevirisi yok
VEFA AHSEN
Doktora
Türkçe
1984
Kimya MühendisliğiUludağ ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ÖZER BEKAROĞLU
- NH3 için önerilen yeni bir gerçek gaz hal denklemi ve bu hal denklemi ile bazı moleküler-fiziksel özelliklerin saptanması
Başlık çevirisi yok
MERAL HOŞCAN
- Purification of bacteriorhodopsin from halobacterium halobium and reconstitution studies in liposomes
Başlık çevirisi yok
M.BAKER ZABUT
Yüksek Lisans
İngilizce
1987
BiyokimyaOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyokimya Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. MERAL YÜCEL
- Balb/c farelerinin kan serum proteinleri üzerinde UV-C ışınlarının etkilerinin poliakrilamid gel elektroforezi yöntemleriyle incelenmesi
Başlık çevirisi yok
N.ERSİN BAYRAKDAR