Kanser kökenli hücre hatlarında gözlenen sessiz tümör süpresör gen mutasyonlarının mrna işlemlenmesi üzerine olası etkilerinin saptanması
Probable effects of silent mutations observed in tumor suppressors genes on mrna spli̇ci̇ng in cancer originated cell lines
- Tez No: 494382
- Danışmanlar: PROF. DR. OĞUZ ALTUNGÖZ
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Tıbbi Biyoloji, Genetik, Medical Biology, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2017
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Dokuz Eylül Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Memeli genlerinin transkript ürünleri öncü bir mRNA (pre-mRNA) olarak sentezlenir ve genelde alternatif kesip ekleme mekanizması ile tek pre-mRNA biriminden çok sayıda mRNA oluşturulur. Doğru mRNA işlemlenmesi klasik kesip ekleme sinyal motiflerine ilave olarak; kesip eklemeyi güçlendiren, 'exonic-intronic splicing enhancers' (ESEs-ISEs) ve engelleyen 'exonic-intronic splicing silencers' (ESSs-ISSs) düzenleyici elementlere ihtiyaç duyar. ESE ve ESS dizilerini bozan mutasyonlar hatalı mRNA ürünlerinin oluşumuna yol açabilirler. mRNA işlemlenmesini bozan mutasyonlar genelde güdük ve işlevsel olmayan ürünler oluştururlar ve tümör süpresör genlerde (TSG) işlev kaybına yol açan bu tarz mutasyonlar kanser gelişimine katkı sunan sürücü mutasyonlar olarak işlev görebilir. TSG'lerde gözlenen mutasyonların sürücü veya yolcu mutasyonlar olduklarını belirlemek bu genlerin karsinogenez'e etkisini anlamak bakımından önem taşımaktadır. Bu çalışmada TSG'lerde ESE ve ESS dizilerinde gözlenen sessiz mutasyonların hatalı mRNA ürünlerinin oluşmasına yol açarak kanser gelişiminde rol oynayabilecekleri öngördük. COSMIC veri tabanında kayıtlı kültürü yapılmış kanser hücrelerinde belirlenmiş sessiz TSG mutasyonlarını taradık ve pre-mRNA işlemlenmesi üzerine olası etkilerini test etmek amacı ile HSF biyoinformatik analiz sistemini kullandık. Analiz sonucu beş faklı TSG ve bu genlerde gözlenen sekiz farklı sessiz ekzonik mutasyon seçtik. Beş gene ait normal DNA dizileri kontrol gurubunu oluşturmak üzere pET01 plazmid'i içerisine paketlendi. Elde edilen kontrol örnekleri kalıp olarak kullanıldı ve SDM protkolü ile mutasyon oluşturuldu. Kontrol ve mutant plazmid örnekleri HeLa hücreleri içerisine transfekte edildi. Transfekte hücrelerden total-RNA izole edildi ve cDNA sentezlendi. Mutasyon içeren cDNA bölgeleri PCR ile çoğaltıldı ve ürünlerinin dizi analizleri yapıldı. Yapılan DNA dizi analizleri sonucunda CDKN2A (2. Ekzon), TP53 (8. Ekzon), BAI3 (8. Ekzon), CABLES2 (8. Ekzon) ve PTCH2 (2. Ekzon) genlerine ait kontrol örneklerinde mRNA'nın doğru şekilde işlendiği görüldü. Çalışmada, CDKN2A (2. Ekzon; c.273G>A, c.339G>T, c.342C>G), TP53 (8. Ekzon; c.793C>T ve c.801G>T), BAI3 (8. Ekzon; c.1419C>T), CABLES2 (8. Ekzon; c.1002C>T) ve PTCH2 (2. Ekzon; c.249A>G) genlerine ait sessiz mutasyonların DNA analiz sonuçları hiçbir örneğin hatalı mRNA ürünü oluşumuna neden olmadığını göstermiştir. Bu çalışmada, mutasyonların mRNA işlemlenmesi üzerine olan etkisinin araştırılmasında minigene splicing assay sistemi kullanımının primer olarak temini zor olan dokular için faydalı bir model olabileceği görülmektedir. Seçtiğimiz sekiz TSG mutasyonun minigene splicing assay sonuçları, hiçbir mutasyonun mRNA işlemlenmesini bozmadığını göstermektedir. Dolayısıyla seçilen sekiz mutasyonunda kanser gelişiminde etkisi olmayan yolcu (passenger) mutasyon gibi davranabileceği yönünde sonuçlar elde edilmiştir.
Özet (Çeviri)
Transcription of mammalian genes is synthesized as a pre-mRNA unit and generally forms several isoform from the same transcription unit by alternative splicing mechanisms. In adition to clasical splicing signal patterns, the acurracy of mRNA splicing is depended on such aditional splicing regulatory elements as exonic-intronic splicing enhancers (ESEs-ISEs) and exonic-intronic splicing silencers (ESSs-ISSs). The mutations disrupting the ESE and ESS motifs may result in aberrant splicing products. The mutations that alter mRNA splicing generally generate short and unfunctional products, and such mutations leading to the loss of function in tumor suppressor genes (TSG) may act as driver mutations contributing to the cancer development. Identification of whether the mutations observed in TSGs is driver or passenger mutation is important to understand their effects on carcinogenesis. We suggest that mutations in ESE and ESS motifs result in defective pre-mRNA splicing corresponding to inactivation in TSG model and contribute the cancer progression. We searched for the silence mutations in TSG adopted from COSMIC database which are identified in cultered cancer cells and HSF analysis was used to test for the determination of probable effects of mutations on mRNA splicing. We chosed the eight different silence exonic mutations in the five different TSGs after bioinformatic analysis. Normal DNA sequences of the five different gene were independently packed in the plasmid, pET01 in order to create control groups. Control samples we obtained were used as molds and mutations were obtained via side directed mutagenesis (SDM) protocol. Plasmids, for both control and mutated, were transfected to HeLa cells. Total RNA was isolated from transfected cells and converted to cDNA. The regions harbouring mutations in cDNA were amplified via PCR and PCR products were sequenced. The DNA sequence analysis revealed that mRNA splicing was correctly processed for CDKN2A (2nd exon), TP53 (8th exon), BAI3 (8th exon), CABLES2 (8th exon) ve PTCH2 (2nd exon) in control samples. In the current study, the results of DNA analysis showed that silence mutations of CDKN2A (2nd exon; c.273G>A, c.339G>T, c.342C>G ), TP53 (8th exon; c.793C>T, c.801G>T), BAI3(8th exon; c.1419C>T), CABLES2 (8th exon; c.1002C>T) and PTCH2 (2nd exon; c.249A>G) did not cause to abberant mRNA products. In this study, it is shown that minigene splicing assay may be useful model to test effects of mutations on the mRNA processing for primer tissues that are difficult to obtain. The results of minigene splicing assay showed that the eight different mutations did not disrupt mRNA processing. Therefore, these result were obtained from selected eight mutations may act as a passenger mutation that had no effect on the development of cancer.
Benzer Tezler
- 1981 Türkiye tarımsal yapısının önemli bileşenleri ve tarımsal bölgelerin elde edilmesi
Principle components of Turkey's agricultural structure and to determine agricultural rigions in 1981
İHSAN KARABULUT
- Pseudamanas syringae ve pathavarlarının tanılanmalarında biyokimyasal ve morfolojik özelliklerin belirlenmesi üzerinde araştırmalar
Başlık çevirisi yok
A.ALEV GÖKDEMİR
Yüksek Lisans
Türkçe
1987
ZiraatEge ÜniversitesiBitki Koruma Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. HİKMET SAYGILI
- Kreatin kinaz izozimlerinin sıçan kalbinden saflaştırılması kinetik özelliklerinin ve nitrozolu karsinojen bileşiklerin etkilerinin araştırılması
The Investigation on creatine kinase isozymes purfied from mouse liver kinetic properties and the effects of carcinogen nitroso compounds
YÜKSEL KOCA