Pichia pastoris mayalarından rekombinant ekspanzin üretiminin optimizasyonu
Optimization of recombinant expansin production from Pichia pastoris yeast
- Tez No: 478424
- Danışmanlar: DOÇ. DR. HASAN VARDİN
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2017
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Harran Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Bu çalışmada Solanum lycopersicum (domates) bitkisinden ekspanzin üretiminden sorumlu gen bölgesi (LeExp1) izole edilerek metilotropik bir maya olan Pichia pastoris mayalarında rekombinant olarak ekspanzin proteinlerinin üretilmesi sağlanmıştır. LeExp1 gen dizilimi sırasıyla alfa mating faktör (AMF) ve Pichia pastoris asit fosfataz (PHO1) sekresyon sinyal sekanslarına sahip pPIC9K ve pHIL-S1 vektörlerine uygun enzimler vasıtasıyla aktarılmıştır. Hedef gen ile klonlanmış vektörler ısı şoku yolu ile E. coli JM109 hücelerine transforme edilmiş ve burada çoğaltılmıştır. Klonlanan vektörler elektroporasyon vasıtasıyla Pichia pastoris GS115 ve SMD1168 suşlarına transfer edilmiştir. PZR yöntemiyle transfer işlemi doğrulanmıştır ve elde edilen dört adet transgenik suştan ekstraselülar rekombinant protein üretimi AOX1 promotörü kontrolünde, pH 6.0'da, 200 rpm'de, 30°C'de 96 saat boyunca gerçekleştirilmiştir. Eksprese edilen toplam protein miktarı Bradford assay analizleri ile hesaplanmış ve elde edilen proteinler SDS-PAGE yöntemi ile poliakrilamid jel üzerinde görüntülenmiştir. Western-Blot yöntemi ile poliklonal ekspanzin antibadileri kullanılarak ekspanzin proteinleri tanımlanmıştır. Elde edilen ekspanzin proteinlerinin meyve suyu endüstrisinde kullanılan selülozik enzimlere olan sinerjistik etkileri araştırılmıştır. Çalışma sonunda pPIC9K vektörünü taşıyan, proteaz enzimleri inhibe edilmiş SMD1168 transgenik suşundan 283 mg/L düzeyinde, GS115 suşuna göre yaklaşık olarak 1.4 kat daha fazla rekombinant ekspanzin proteini elde edilmiştir.
Özet (Çeviri)
In this study LeExp1 gene from Solanum lycopersicum (tomato) genome was isolated and recombinantly expressed in methylotropic Pichia pastoris in order to produce expansin proteins. Open reading frame of LeExp1 gene transferred to pPIC9K and pHIL-S1 vectors containing alpha mating factor and acid phosphatase secretion signals, respectively. The vectors harboring target gene subcloned to E. coli JM109 competent cells via heat-shock method. The cloned vectors were transformed to Pichia pastoris GS115 and Pichia pastoris SMD1168 strains by electroporation. The presence of the transgene in Pichia pastoris genome was verified by Polymerase Chain Reaction (PCR) and recombinant expansin protein expression was carried under the control of AOX1 promoter, at pH 6.0, 30oC, 200 rpm for 96 hours from four different transgenic strains (GS115-pPIC9K-Exp1, GS115-pHIL-S1-Exp1, SMD1168-pPIC9K-Exp1, SMD1168-pHIL-S1-Exp1). The amount of expressed of total proteins were determined by using Bradford Assay and recombinant proteins separated and visualized on polyacrylamide gels (SDS-PAGE). Immunodetection of recombinant expansin proteins were conducted by using polyclonal tomato expansin antibodies. The synergistic activity of recombinant expansin proteins on cellulolytic enzymes were investigated. The higher amount of proteins were obtained from SMD1168-pPIC9K-Exp1 and SMD1168-pHIL-S1-Exp1 cell lines compared to those of GS115 lines. The proteins obtained from SMD1168 cells displayed higher synergistic activity with celluloytic enzymes compared to recombinant proteins obtained from GS115 cells.
Benzer Tezler
- Extracellular recombinant human growth hormone production by Pichia pastoris
Pichia pastoris ile hücredışı insan büyüme hormonu üretimi
MEHMET ALİ ORMAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2007
Kimya MühendisliğiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. PINAR ÇALIK
PROF. DR. TUNÇER H. ÖZDAMAR
- Effects of pH on human growth hormone production by Pichia pastoris considering the expression levels of regulatory genes
Pichia pastoris ile insan büyüme hormonu üretiminde düzenleyici genlerin ifade düzeylerini dikkate alarak pH etkisinin incelenmesi
EDA BAYRAKTAR
Yüksek Lisans
İngilizce
2009
BiyomühendislikOrta Doğu Teknik ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DR. REMZİYE YILMAZ
PROF. DR. PINAR ÇALIK
- Pichia pastoris organizmasında rekombinant protein üretimi için sekresyon vektörü konstrüksiyonu
Construction of a secretion vector for recombinant protein expression in Pichia pastoris
RAHİME OĞUL
Yüksek Lisans
Türkçe
2010
BiyoteknolojiGaziosmanpaşa ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. İSA GÖKÇE
- Recombinant human growth hormone production by Pichia pastoris and determination of its interaction with peptide ligands
Pichia pastoris ile rekombinant insan büyüme hormonu üretimi ve peptit ligandlarla etkileşiminin incelenmesi
BAHAR İNANKUR
Yüksek Lisans
İngilizce
2010
Kimya MühendisliğiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiKimya Mühendisliği Bölümü
PROF. DR. BURAK ERMAN
PROF. DR. PINAR ÇALIK
- Pichia pastoris organizması yeşil floresans proteini (GFP) füzyon vektörünün konstrüksiyonu
Construction of a Pichia pastoris green fluorescence protein fusion vector
GÖZDE KÖKSÜZ ŞENKAL