Mikroorganizmalarda insan proinsülin proteininin üretilmesi ve analizi
Production and analysis of human proinsulin protein in microorganisms
- Tez No: 461105
- Danışmanlar: PROF. DR. KADİR TURAN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyokimya, Biochemistry
- Anahtar Kelimeler: Diabetes mellitus, Elektroforez, Pichia pastoris, Rekombinasyon-genetik, İnsülin, Diabetes mellitus, Electrophoresis, Pichia pastoris, Recombination-genetic, Insulin
- Yıl: 2017
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Marmara Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyokimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Amaç: Bu tez çalışmasında insan prekürsör insülin proteinlerinin Pichia pastoris ve Escherichia coli hücrelerinde rekombinant olarak üretilmesi ve bu hücrelerin insülin sentez etme kapasitelerinin karşılaştırılması amaçlandı. Gereç ve Yöntem: İnsan insülin proteinini kodlayan gen, insan orijinli HeLa hücrelerinden elde edilen genomik DNA üzerinden polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile hazırlandı. Elde edilen insülin geni pPink-HC, pET-14b ve pGFP plazmit vektörlerine klonlandı. Oluşturulan plazmit vektörlerin ön kontrolleri uygun restriksiyon enzdonükleaz enzimleri ile kesildikten sonra agaroz jel elektroforezi teknikleri ile yapıldı. Plazmitlerin nihai kontrolleri DNA dizi analizleri ile gerçekleştirildi. Plazmitler kimyasal yöntemle ve/veya elektroporasyon yöntemiyle konak hücrelere transforme edildi. Farklı ortam koşullarında üretilen hücrelerde sentez edilen insülin prekürsör proteinleri poliakrilamid jel elektroforezi ve Western melezleme teknikleri ile incelendi. Bulgular ve Sonuç: HeLa hücrelerine ait genomik DNA üzeriden PZR ile çoğaltılan insan insülin geni DNA fragmentindeki intron bölgesi invers (ters) PZR tekniği ile çıkartılarak, maya ve bakteri ekspresyon vektörlerine başarılı bir şekilde klonlandı. Pichia pastoris maya hücrelerine plazmit aktarımında elektroporasyon yönteminin kimyasal yönteme göre çok daha etkili olduğu saptandı. Plazmit aktarılan P. pastoris hücrelerinin genomlarında insülin genini taşıdıkları PZR ile belirlendi. Elde edilen maya ve bakteri transformantlarından hazırlanan total protein örneklerinde prekürsör insülin proteinleri Western melezleme tekniği ile belirlendi. Transformant maya kültürleri salgı formunda proteinler için de analiz edildi, fakat salgı formunda insülin belirlenemedi. Pichia pastoris hücrelerinde, E. coli hücrelerine göre çok düşük düzeylerde insülin proteini sentez edildiği görüldü. Bunun, çalışmada P. pastoris için kullandığımız plazmitler vektörlerden, hücreleri üretme koşullarından ve/veya konak proteaz aktivitesinden kaynaklanabileceği sonucuna varıldı.
Özet (Çeviri)
Aim: In this thesis, it was aimed to produce recombinant human precursor insulin proteins in Pichia pastoris and Escherichia coli cells and to compare insulin synthesis capacities of these cells. Material and Methods: The gene encoding human insulin was amplified with polymerase chain reaction (PCR) by using the genomic DNA of HeLa cells. The resulting insulin gene fragments were cloned into pPink-HC, pET-14b and pGFP plasmids. Preliminary controls of the recombinant plasmids were carried out with restriction enzyme digestions followed by agarose gel electrophoresis. Final control of plasmids was carried out by DNA sequencing. Plasmids were transformed into the host cells by chemical method and / or electroporation. The insulin proteins synthesized in the cells grown in different culture conditions were examined by polyacrylamide gel electrophoresis and Western blotting. Results and Discussion: After removing of the intron region of insulin gene amplified from genomic DNA of HeLa cells with PCR by using inverse PCR technique, the resulting DNA fragmentswere successfully cloned into the expression vectors.The electroporation method for plasmid transformation to P. pastoris was found more effective compering to chemical methodes. Integrated insulin genes into the genom of P. pastoris were identified by PCR. The insulin proteins in total protein samples extracted from transformant yeast and bacteria were analysed with Western blotting.Transformant yeast cultures were also analyzed for secreted proteins, but it could not be identified secreted insulin. Comparing to E. coli, very low level of insulin protein was synthesized in P. pastoris cells. It was concluded that the low level insulin synthesis may depend on the expression plazmits, culture conditions and / or protease activity of P. pastoris.
Benzer Tezler
- The role of oxidative stress factors in the pathophysiology of Ocular Rosacea, analysis of tears and other materials
Oküler Rosacea patofizyolojisinde oksidatif stres faktörlerinin rolü, gözyaşı ve diğer materyallerin analizi
NİLÜFER YEŞİLIRMAK
Doktora
İngilizce
2023
BiyokimyaGazi ÜniversitesiTıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NESLİHAN BUKAN
PROF. DR. JEAN-LOUIS BOURGES
- İnsan immunoglobulin G1 bağlayan mikroorganizmaların saptanması için yöntem geliştirilmesi
Establishment of A method to detect human immunoglobulin G1 binding microorganisms
OLKAR HIGRAN ABDULMAJED ABDULMAJED
Doktora
Türkçe
2018
Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik MikrobiyolojiGazi ÜniversitesiTıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. KAYHAN ÇAĞLAR
- Boğaçay'ın (Antalya) denize döküldüğü alandaki çoklu antibiyotik dirençli bakterilerin yaz ve kış mevsimlerinde karakterizasyonu
Characterization of multiple antibiotic resistant bacteria from disembogue area of Boğaçay (Antalya) during summer and winter seasons
SİDE SELİN SU YİRMİBEŞOĞLU
Yüksek Lisans
Türkçe
2020
MikrobiyolojiAkdeniz ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ BURCU EMİNE TEFON ÖZTÜRK
- Bor İçeriği Yüksek Maden Toprağının Toksik Etkilerinin Farklı Yöntemlerle Araştırılması
The investigation of the toxic effects of mine soil with high boron concentration with different methods
SERHAN KARAKAŞ
Yüksek Lisans
Türkçe
2017
GenetikEskişehir Osmangazi ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AHMET ÇABUK
DR. ÖĞR. ÜYESİ FERHAN KORKMAZ
- Development of protease resistant antimicrobial peptides
Proteazlara dirençli antimikrobiyal peptitlerin geliştirilmesi
BETÜL ZEHRA KARAKUŞ
Yüksek Lisans
İngilizce
2020
BiyoteknolojiAcıbadem Mehmet Ali Aydınlar ÜniversitesiMedikal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZÜHTÜ TANIL KOCAGÖZ
DR. ÖĞR. ÜYESİ ZEYNEP KANLIDERE