Geri Dön

CRISPR-Cas9 based investigation of chromatin modifiers in human somatic cell reprogramming

CRISPR-Cas9 aracılığı ile kromatin modifiye eden genlerin insan hücre yeniden programlanmasında incelenmesi

PDF İndir

  1. Tez No: 435866
  2. Yazar: CAN AZTEKİN
  3. Danışmanlar: YRD. DOÇ. DR. TEVFİK TAMER ÖNDER
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Moleküler Tıp, Molecular Medicine
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2016
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Koç Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyomedikal Bilimler ve Mühendislik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

Somatik hücrelerin Oct4, Sox2, Klf4 ve c-Myc transkripsiyon faktörleri ile pluripotensiye yeniden programlanması, epigenomun kromatin modifiye edenler aracılığıyla yeniden biçimlenmesiyle gerçekleşir. Bu bağlamda çalışılan genlerin bazıları yeniden programlamanın bariyer ve gerekli genleri olarak adlandırılmıştır. Bununla birlikte gelişen protokollerle yapılan geniş kapsamlı çalışmaları, yeniden programlanmanın beraberinde gelen shRNA verktörlerinin susturulmaya duyarlılığı ve bu genlerin knockout olduğu insan hücre hatlarının bulunmaması sınırlandırıyor. Böylece, yeniden programlanmanın farklı evrelerinde bu genlerin kalıcı modifikasyonuyla CRISPR-Cas9 knockout kütüphanesi kullanarak kromatin modifiye edenlerin sistematik incelenmesi hipotezini belirledik. Bu amaçla, 247 histon ve DNA modifiye eden kromatin yeniden düzenleyiciler, yazıcılar, okuyucular ve siliciler içeren kromatin modifiye edenlerin CRISPR-Cas9 kütüphanesi oluşturuldu. Ardından bu kütüphane, heterojen hücre popülasyonu oluşturulması ve sonrasında OSKM ile yeniden programlanmaya tabi tutulmasında kullanıldı.Bunun için, FACS aracılığıyla ayrıştırılmış Tra-1-60 pozitif ve retroviral yolla eksojen olarak üretilen yeşil floresan proteinleri (EGFP) susturulmuş hücrelerden elde edilen uPKH'lerden farklı zaman aralıklarında toplanılanlar kullanıldı. İzole edilen hücrelerde CRISPR rehber RNA'ların miktarı ileri nesil sekanslama yöntemi ile belirlendi. Spesifik rehber RNA'ların çokluğunun analizi, önceden çalışılmış ve ispatlanan somatik hücrelerin yeniden programlanmasının düzenleyicilerini doğruladı ve farklı dönemlere özgü yeni bariyer ve gerekli düzenleyiciler saptandı. Bunlardan PAXIP1, BRD2 ve USP22 bariyer ve CHAF1A, KDM8 ve PRMT5 gerekli düzenleyiciler olarak belirlendi. Üstelik gen kümelerinin işleve dayalı analizi, MLL komplekslerinin yeniden programlanmanın muhtemel bariyeri, BAF, SWI/SNF ve MOZ/MORF komplekslerinin de önemli düzenleyiciler olarak görev aldıklarını açıkladı. Tarama sonuçlarına dayanarak, farklı dönemlere özgü inhibitörlerin kombinasyonlarının kullanılmasının, yeniden programlanmayı hızlı ve daha verimli hale getirdiği görüldü. Bu çalışma yeniden programlamanın kromatin bazlı engellerinin açıklanmasına ve daha verimli yeniden programlama yolları için rehber olacaktır.

Özet (Çeviri)

Reprogramming of somatic cells to pluripotency via four transcription factors, Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (OSKM) involves extensive remodeling of the epigenome which is carried out by a number of chromatin modifiers. A number of these genes have been studied in the context of reprogramming and defined as barriers or essential regulators of this process. However, established protocols limit a comprehensive examination due to the susceptibility of shRNA vectors to proviral silencing which accompanies reprogramming, and the unavailability of human knock-out cell lines. Therefore, we hypothesized that pooled CRISPR-Cas9 knock-out libraries can enable systematic investigation of chromatin modifiers and reveal their role in different steps of reprogramming by enabling permanent gene modifications. To this end, we constructed a CRISPR-Cas9 knock-out library targeting the 247 chromatin modifiers including chromatin remodelers, writers, readers and erasers of histone and DNA modifications. We utilized this library to generate heterogeneous cell populations harboring putative chromatin modifier knock-outs, which were then reprogrammed with the delivery of OSKM. FACS-based enrichment of TRA-1-60 positive cells, and low copy exogenous retroviral EGFP silencing was utilized to collect emerging iPSCs at different time points of reprogramming. The abundance of CRISPR guide RNAs in isolated cells were determined by next generation sequencing. Analysis of relative enrichment of specific guide RNAs confirmed the majority of the known reprogramming regulators and identified novel stage specific barriers and essential regulators for human somatic cell reprogramming. These include PAXIP1, BRD2 and USP22 as barriers, and CHAF1A, KDM8 and PRMT5 as essential regulators. In addition, functional analysis based on class of genes revealed that various MLL complexes act as barriers, and BAD, SWI/SNF, and MOZ/MORF complexes act as essential regulators for reprogramming. Based on the screen results, stage specific combinatorial use of small molecule inhibitors enabled accelerated and more synchronous efficient reprogramming. Taken together this study establishes roadblocks of reprogramming through chromatin landscape, and can guide more efficient reprogramming strategies to be formulated.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    414069

    Generation and characterization of familial mediterranean fever (FMF) disease-specific induced pluripotent stem cells (iPSCs)

    Ailesel Akdeniz ateşi hastalığına spesifik uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretimi ve karakterizasyonu

    KEREM FİDAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2015

    BiyolojiKoç Üniversitesi

    Biyomedikal Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. TEVFİK TAMER ÖNDER

  2. Tez No

    459449

    Implementation of CRISPR based technologies for genome and gene expression manipulation of IRF4 in melanoma cells

    CRISPR temelli teknolojilerin melanoma hücrelerinde IRF4'ün gen ve genom ifadesinin manipülasyonu amacıyla uygulanması

    CANSU YERİNDE

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2016

    BiyomühendislikBoğaziçi Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. NEŞET CEVDET TOLGA EMRE

  3. Tez No

    418841

    Generation of a CRISPR/Cas based genome editing system for MEFV gene in familial mediterranean fever-specific induced pluripotent stem cells

    Ailesel Akdeniz ateşine özgü uyarılmış pluripotent kök hücrelerdeki MEFV geni için CRISPR/Cas temelli genom yazılım sisteminin oluşturulması

    GÜLNİHAL KAVAKLIOĞLU

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2016

    GenetikKoç Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. TEVFİK TAMER ÖNDER

  4. Tez No

    643221

    Development of small molecule and CRISPR based approaches in endothelial cell growth

    Endotel hücre büyümesinde küçük molekül ve CRISPR temelli yaklaşımların geliştirilmesi

    SEZER AKGÖL

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2020

    BiyoteknolojiYeditepe Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. FATİH KOCABAŞ

  5. Tez No

    573268

    Comparison of screening methods for CRISPR/CAS9-inducedmutations

    CRISPR/CAS9-indüklenmiş mutasyonlar için görüntüleme yöntemlerinin karşılaştırılması

    ASENA CANTÜRK

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2019

    BiyoteknolojiGebze Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. NURİ ÖZTÜRK

Geri Dön