Geri Dön

Isolation and characterization of a novel tyrosinase enzyme from native bacterial straine, production of the enzyme by cloning, characterization of the recombinant enzyme and analysis of its biotechnological applications such as production of l-dopa and melanin

Doğal bakteri suşlarından tirozinaz enzim izolasyonu, karakterizasyonu, üretici genin klonlanması, rekombinant enzimin karakterizasyonu ve l-dopa ve melanin üretimi gibi biyoteknolojide kullanılabilirliği

PDF İndir

  1. Tez No: 394619
  2. Yazar: EBRAHİM VALİPOUR
  3. Danışmanlar: PROF. DR. BURHAN ARIKAN
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Mikrobiyoloji, Biyoloji, Biyoteknoloji, Microbiology, Biology, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Bakteri izolasyonu, Gen klonlama, Moleküler klonlama, İstatistiksel deney tasarımı, Bacterial isolation, Gene cloning, Molecular cloning, Statistical experimental design
  7. Yıl: 2015
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Çukurova Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

Tirozinaz, L-tirosin'in L-DOPA'ya ve son olarak melanin'e dönüşümünü katalize eden tip-3 bakır içerikli bir enzimdir. Melanin, biyoteknolojik ve biyolojik fonksiyonları ile geniş bir yelpazeye sahiptir ve ilaçbilim, kozmetik ve başka endüstri alanlarda yaygın olarak kullanılmaktadır. L-DOPA, Parkinson hastalıkları tedavisinde tercih edilen bir ilaçtır. Bu çalışmada, tirozinaz enzimi bulunduran bir Bacillus türü doğadan izole edilmiştir ve bu suş morfolojik, biyokimyasal ve moleküler analiz ile tanımlanmıştır. Doğal izolattan enzimin üretimi klasik ve istatistiki metotlar (Box-Behnken dizaynı) ile optimize edilmiş ve enzim karakterize edilmiştir. dahasonra, tirozinaz kodlayan gen ekspresyon vektörü olarak pET22b kullanılarak iki ekspresyon sisteminde (E.coli BL21 (DE3) pLysS and Rosetta-gami 2 (DE3) pLysS) klonlanmıştır. İki sistemindeki gen ekspresyonları karşılaştırılmıştır. Gen fragmenti, Sanger sekanslama metoduyla selamlanmıştır. Sekans, farklı biyoinformatik programları ve web siteleri kullanarak insiliko analize tabi tutulmuştur. L-tirozin'in L-DOPA ve melanine dönüşmesi TLC ve HPLC yöntemleri ile saptanmıştır. Üretilen melanin incelenmiştir. İzole edilen suş Bacillus megaterium ile %99 homoloji göstermiştir. Doğal M36 Bacillus türünden enzimin üretimi 0.05 IU/ml olarak belirlenmiştir. Kültür koşullarının optimizasyonundan sonra 0.38 IU/ml'ye ulaşmıştır. Rekombinant M36 tirozinaz enziminin ekspresyonunun optimizasyonundan sonra ise 31 IU/ml'ye ulaşmıştır. Doğal ve rekombinant M36 tirozinaz enzimi için optimum sıcaklık sırasıyla 40 °C ve 45-50 °C; optimum pH sırasıyla 7.0 ve 7.5 idi. SDS-PAGE analizinde, doğal ve rekombinant M36 tirozinaz enzimi sırasıyla 34kDa ve 35 kDa olarak belirlenmiştir. Bu çalışmada üretilen M36 melanin, FT-IR ve EPR analizine göre Sigma standart sentetik melanin ile yapısal benzerlik göstermiştir. Aynı zamanda, üretilen M36 melanin önemli anti-bakteriyel, anti-UV ve anti-oksidan etki göstermiştir. MTT deneyi, M36 melaninin anti-kanser etkisi olduğunu göstermiştir.

Özet (Çeviri)

Tyrosinase is a type 3 copper-containing enzyme that catalyzes the conversion of L-tyrosine to L-DOPA and finally to melanin. Melanin has a broad spectrum of biotechnological and biological functions and it is widely used in pharmacology, cosmetics and other industrial fields. L-DOPA is the preferred drug for treatment of Parkinson's diseases. In this study a Bacillus sp. having tyrosinase enzyme was isolated from native and the strain was identified by morphological, biochemical and molecular analysis. Production of the enzyme by the native isolate was optimized using classical and statistical (Box- Behnken design) methods and the enzyme was characterized. After that the tyrosinase coding gene was cloned in two expression system (E.coli BL21 (DE3) pLysS and Rosetta-gami 2 (DE3) pLysS) using pET22b as an expression vector and expression of the gene in the two expression system was compared. The gene fragment was sequenced using with Sanger sequencing method. The sequence was subjected to insilico analysis using different bioinformatics programs and websites. Conversion of l-tyrosine to L-DOPA and melanin was evaluated by TLC and HPLC methods. The isolated strain showed up to 99% homology with Bacillus megaterium. Production of the enzyme by the native M36 Bacillus sp. was determined as 0.05IU/ml, after optimization of culture condition it was reached to 0.38 IU/ml; also this product was reached to 31 IU/ml after optimization of expression of recombinant M36 tyrosinase enzyme. The optimum temperature for native and recombinant M36 tyrosinase activity was 40 °C and 45-50°C also; optimum pH for native and recombinant enzyme activity was 7.0 and 7.5 respectively. In SDS-PAGE analysis the native and recombinant M36 tyrosinase enzyme determined as 34kDa and 35 kDa, respectively. M36 melanin produced in this research, showed structural similarity with standard synthetic melanin from sigma according to the solubility, FT-IR and EPR analysis. Also it showed notable anti-bacterial, anti-UV and ant-oxidant effects. MTT assay showed the M36 melanin to have anti-cancer effect.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    116541

    Isolation, characterization and synthesis of taxol units and a novel manganese(III) acetate mediated synthesis of biaryls

    Taksol birimlerinin izolasyonu, karakterizasyonu, sentezi ve biarillerin yeni bir yöntemle manganez(III) asetat ortamında sentezlenmesi

    EMİNE ÖZGÜL KARAASLAN

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2001

    KimyaOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    PROF.DR. AYHAN S. DEMİR

  2. Tez No

    285379

    Thermus sp. K6' dan yeni, kriptik, küçük, çok kopyalı bir plazmitin (pHIG22) izolasyonu ve kısmi karakterizasyonu

    Isolation of a novel, cryptic low molecular-weight, multicopy plasmid, pHIG22, from Thermus sp. K6 and its partial characterization

    HALİL İBRAHİM GÜLER

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2011

    BiyolojiKaradeniz Teknik Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ALİ OSMAN BELDÜZ

  3. Tez No

    724803

    Metagenomik yaklaşımla elde edilen endoglukanaz enziminin rekombinant ekspresyonu ve karakterizasyonu

    Recombinant expression and characterization of a novel endoglucanase enzyme obtained by metagenomics approach

    FURKAN ABDULLAH ÇALIŞ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2022

    MikrobiyolojiYıldız Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ EMEL ORDU

    DR. GÜNSELİ KURT GÜR

  4. Tez No

    643065

    pRTA, yeni bir vektör ve TA klonlama: Bilinmeyen antibiyotik direnç genlerinin karakterizasyonu için yöntem

    pRTA, a new vector and TA cloning: A method for characterization of novel antibiotic resistance genes

    HANİFE SALİH

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2020

    BiyoteknolojiAydın Adnan Menderes Üniversitesi

    Moleküler Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. BÜLENT BOZDOĞAN

  5. Tez No

    121022

    Isolation and molecular characterization of lactic acid bacteria from raw milk

    Çiğ sütten laktik asit bakterilerinin izolasyonu ve moleküler karakterizasyonu

    ALİ EMRAH ÇETİN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2002

    Biyoteknolojiİzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ.DR. HATİCE GÜNEŞ

    PROF.DR. ŞEBNEM HARSA

    Y.DOÇ.DR. ALİ FAZIL YENİDÜNYA

Geri Dön