Geri Dön

İnsan URG-4 (Up-Regulated Gene 4) geninin transkripsiyonel regülasyonu

Transcriptional regulation of human URG-4 (Up Regulated Gene 4) gene

PDF İndir

  1. Tez No: 373233
  2. Yazar: ESRA TOKAY
  3. Danışmanlar: PROF. DR. FERAY KÖÇKAR
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoloji, Biology
  6. Anahtar Kelimeler: Sitokinler, Cytokines
  7. Yıl: 2014
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Balıkesir Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

Up-regulated gene 4 (URG-4) geni, ilk olarak HBxAG proteinin doğal regülatörü olarak bulunmuştur. Sitokinlerle regülasyonu ve transkripsiyonel aktivitesi ile ilgili literatürde herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. URG-4 geninin transkripsiyonel aktivitenin belirlenmesi için, yaklaşık 530 bç'lik (-482/+63) ve minumum transkripsiyonel aktivitenin belirlenmesi için, kısaltılarak yapılmış promotor parçalar (-109/+63, -261/+63, -344/+63) PCR'a dayalı GC zengin stratejiler uygulanarak çoğaltıldı ve pMetLuc lusiferaz haberci vektör içerisine klonlandı. 530 bç lik promotor bölgesi NCBI gen bankasına kayıt edildi. Promotor bölgesinin TATA kutusu içermediği ve % 80 GC zengin bir bölge olduğu belirlendi. Transkripsiyon faktörü (TF) bağlanma motifleri incelendiğinde özellikle SP1 gibi çok sayıda TF bağlanma bölgesi içerdiği tespit edilmiştir. Transkripsiyonel aktivite için, URG-4 promotor parçaları, kalsiyum fosfat tekniği ile insan Karaciğer Kanser Hücre hattına (Hep3B) geçiçi transfeksiyon metodu kullanılarak aktarıldı. -109/+63 promotor parçasının bazal aktivitesinin en yüksek olduğu bulundu. Ayrıca kotransfeksiyon çalışmaları, hSP1 ve hUSF transkripsiyon faktörlerinin URG-4 promotorunun transkripsiyonel aktivitesini arttırdığı tespit edildi. DNA-protein etkileşim (EMSA) deneyleri, SP1 TF'nün -121/-159 bölgesine bağlandığını göstermiştir ve spesifik yarışma ve antikor süpershift deneyleri SP1'in bağlanmasını doğrulanmıştır. RT- PCR deneyleri SP1 aşırı ifadesinin URG4 mRNA'sını arttırdığı da tespit edilmiştir. URG-4 geni ve sitokinlerle ilişkisini aydınlatmak için, TGF-β ve TNF-α seçildi. Sitokinlerin etkisi hem mRNA hem de protein seviyesinde gösterildi. TGF-β sitokinin erken saatlerde URG-4 geninin ekspresyonunu mRNA ve protein seviyesinde arttırdığı ve TNF-α sitokininin ise 200Ü/mL doz uygulandığında arttırıcı etkisi olduğu görüldü. Aynı arttırıcı etki hepatoma olmayan yan model olarak seçilen prostat kanseri (PC3) hücrelerinde de tespit edildi. Yolak çalışmaları sonucunda TGF-β sitokinin MAPK/ERK yolağı üzerinden URG-4 genini etkilediği, TNF-α sitokininin ise JNK yolağıyla bağlantılı olduğu bulundu. URG-4 Varyant-1 cDNA'sı pCDNA3.2 vektörüne PCR'a dayalı bir teknikle klonlandı. Boş ve URG-4 genini içeren pCDNA3.2 vektörleri geçici olarak Hep3B, kalıcı olarak da Saos-2 hücrelerine transfeksiyonu yapıldı. Genin ektopik ifadesi RT-PCR, qPCR ve western metodları ile doğrulandı. Ayrıca, MTT deneyi ile, genin aşırı ifadesinin hücre proliferasyonuna arttırdığı belirlendi. Koloni formasyon deneyleri sonucunda, hücrelerin koloni oluşturma yeteneğini arttırdığı tespit edildi.

Özet (Çeviri)

URG-4 gene was firstly found as a natural effector of HBxAG protein. There is no information about regulation by cytokines or promoter activity of URG-4 gene. To determine transcriptional activity of URG-4 gene, 530 bp (-482/+63) promotor site of URG-4 gene and truncated deletion constructs were amplified using PCR methods with GC-rich strategies. Then cloned into pMetLuc Lusiferase reporter vector. -482/+63 promoter construct of URG-4 gene was submitted to NCBI data bank. URG-4 promoter is TATAless promoter and contains 80% GC rich seqeunce. Transcription factor binding motifs analysis show the promoter contains many putative SP1 binding sites. For the basal promoter activity, URG-4 promoter constructs were transient transfected by Ca phosphate transfection methods into the Hep3B (Human Hepatoma) cells. -109/+63 URG-4 promotor construct showed the highest transcriptional activity. In addition, cotransfection analysis showed that hSP1 and hUSF upregulate URG-4 promoter constructs. DNA-protein interaction assay (EMSA) shows that SP1 transcription Factor is able to bind to URG-4 promoter sites, -121/-159. Spesific competition assays and antibody supershift assays confirmes the binding of SP1 in to the promoter. RT- PCR also indicates over expression of SP1 upregulates URG4 mRNA expression level in Hep3B cells. To elucidate the effect of cytokines on URG-4 gene expression, cancer related TGF-β and inflamation related TNF-α were chosen. The effects of cytokines on mRNA and protein levels of URG-4 gene were studied. Our results indicated that TGF-β cyctokine effected URG-4 gene and 200 U/mL dose TNF-α showed upregulation of URG-4 gene expression both mRNA and protein level. The same increasing effect was determined in another cell type model, PC-3, prostate cancer cells. According to Pathway inhibitory assay, it was found that TGF-β upregulates URG-4 gene through MAPK/ERK pathway and TNF-α effected by using JNK pathway. Full lenght of URG-4 Variant-1 cDNA was cloned by PCR based approach into pCDNA3.2 eucaryotic expression vector. Expression plasmid that contains URG-4 gene were transient transfected to Hep3B and stable transfected into Saos-2 cells URG-4 expression level was confirmed by using RT-PCR, qPCR and western method. In addition, MTT and colony Forming assays, it was determined that the ectopic expression of URG-4 gene induces proliferative effects of cells.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    53318

    Musiki Mecmuası ve Türk Folklor Araştırmaları Dergisi'nde Türk halk müziği ve oyunları hakkında yazılmış makalelerin bibliyografya incelemesi ve sonuçları

    Başlık çevirisi yok

    AHMET AYDIN

    Sanatta Yeterlik

    Türkçe

    Türkçe

    1996

    Bibliyografyaİstanbul Teknik Üniversitesi

    DOÇ. ŞENEL ÖNALDI

  2. Tez No

    377435

    Analysis and implementation of prediction models for the design of fixed terrestrial point-to-point systems

    Sabit karasal noktadan-noktaya sistemlerinin tasarımı için tahmin modellerinin analizi ve uygulanması

    POLAT GÖKTAŞ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2015

    Elektrik ve Elektronik Mühendisliğiİhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi

    Elektrik-Elektronik Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AYHAN ALTINTAŞ

  3. Tez No

    667000

    Synthesis of urethane functional polymeric resin and ınvestigation of ıts HeAVY metal sorption properties

    Üretan fonksiyonlu polimerik reçinenin sentezlenmesi ve ağir metalleri adsorplama özelliklerinin i̇ncelenmesi

    TUĞBA BUĞDAYCI

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2021

    Kimyaİstanbul Teknik Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. BAHİRE FİLİZ ŞENKAL

  4. Tez No

    33415

    Sivas sokak köpeklerinde görülen helmint türleri, bunların yayılışı ve halk sağlığı yönünden önemi

    The prevalence of Helminths in Stray dogs and their potential public health significance in Sivas

    AHMET DURAN ATAŞ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    1995

    MikrobiyolojiCumhuriyet Üniversitesi

    Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. SEMRA ÖZÇELİK

  5. Tez No

    336853

    Low power range estimation with DSSS technique in underwater acoustics

    Su altı akustiğinde doğrudan dizili yayılı İzge tekniğini kullanarak düşük güç ile mesafe ölçümü

    MUSTAFA OZAN GÜLERYÜZ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2013

    Elektrik ve Elektronik Mühendisliğiİhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi

    Elektrik-Elektronik Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. HAYRETTİN KÖYMEN

Geri Dön