Molecular cloning, overexpression and biochemical characterization of bacterial amylase for biotechnological processes
Biyoteknolojik uygulamalarda kullanılmak üzere bakteriyel amilazın klonlanması, ifadelenmesi ve biyokimyasal karakterizasyonu
- Tez No: 320700
- Danışmanlar: YRD. DOÇ. DR. GÜLŞAH ŞANLI, YRD. DOÇ. DR. H. ÇAĞLAR KARAKAYA
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Amilazlar, Enzim saflaştırması, Moleküler klonlama, Amylases, Enzyme purification, Molecular cloning
- Yıl: 2012
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü
- Enstitü: Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Amilazlar nişasta ve ilgili polisakkaritlerin glikozidik bağlarına etki eden enzimlerdir. Bunlar, çeşitli endüstrilerde kullanılan enzimlerin %25'ini oluştururlar. Endüstriyel işlemler esnasında maltoz, glikoz ve çeşitli uzunluklarda matodekstrinler elde etmek için kullanılırlar. Amilazlar bakteriler, mantarlar, yüksek bitkiler ve hayvanlarda geniş oranda bulunan enzimlerdir. Termofilik enzimler ağır işlem koşullarında kararlı oldukları için geniş oranda tercih edilirler. Termofilik mikroorganizmalardan bu enzimleri üretmek üretim kolaylıkları sebebiyle yükselen bir eğilim olmuştur.Bu çalışmada İzmir Balçova Jeotermal bölgesinden izole edilen termofilik Bacillus sp. suşundan ?-amilaz gen bölgesi kompotent E. coli BL 21 hücrelerine klonlanmıştır. Ek olarak pKJE7 şaperon plazmiti ile protein ifadelenmesi güçlendirilmiştir. Klonlanan gen sekanslanmış ve uzunluğu 1542 bp olarak bulunmuştur. Bu rekombinant suştan 59.9 kD moleküler ağırlığına sasip termofilik amilaz üretilmiş ve saflaştırılmıştır. Kütle spektoskobi analizi yapılmış ve enzim NCBInr veritabanı kullanılarak Geobacillus thermodenitrificans NG80-2 ?-amylase family protein ile eşleştirilmiştir. Bu enzimin aminoasit sekansı bizim elde ettiğimiz enzimle %92 benzer olduğu görülmüştür.Karakterizasyon çalışmalarının sonuçlarına göre, amilaz enziminin en yüksek aktiviteyi pH 8.0 ve 60°C'de gösterdiği görülmüştür. Ayrıca enzimin pH5 ve 9'da kabul edilebilir bir aktiviteye sahip olduğu gösterilmiştir. 70°C'de enzim aktivitesinin %85'ini geri kazanmıştır. Dahası, 65 ve 85°C'deki enzim aktivitesinin sırasıyla 5 ve 2 saat kararlı kaldığı gözlenmiştir. pH7 ve 9'da da aktivitenin 6 saat kararlı olduğu gösterilmiştir. Bazı metal iyonları, kimyasal ajanlar ve organik solventlerin enzim aktivitesine etkileri incelenmiş ve Co+2, Mg+2,Ca+2 iyonlarının enzim aktivitesi için indükleyici olduğu saptanmıştır. Diger taraftan aktivite Cu+2 tarafından inhibe edilmiştir. Ayrıca methanol, DDT and Triton X-100'ün enzim aktivitesi üzerine bir etkisi olmadığı bulunmuştur.
Özet (Çeviri)
Amylases are the enzymes that act on glycosidic bond of starch and related polysaccarides. They comprise 25% of enzyme utilised in a variety of industry. It is used to obtain maltose, glucose and maltodextrins in various lenghts during industrial processes. Amylases are widely distributed enzymes in bacteria, fungi, higher plants and animals. Thermophilic enzymes are widely demanded in order to be stable at harsh process conditions. Isolating these enzymes from thermophilic microorganism is increasing trend because of ease of enzyme production.In this study ?-amylase gene region from a thermophilic Bacillus sp. isolated from Balçova Geotermal region in İzmir was cloned to compotent E. coli BL 21 cells. Additionally protein expression was reinforced with pKJE7 chaperone plasmid. Cloned gene was sequenced and found as 1542 bp in length. Thermophilic amylase that has a 59.9 kD molecular weight was expressed and purified from this recombinant strain. Mass spectrometric analysis were performed and the enzyme was matched with ?-amylase family protein of Geobacillus thermodenitrificans NG80-2 using NCBInr database. The aminoacid sequence of this enzyme was seen to be similar 92% with our obtained enzyme.According to the results of characterization studies, the amylase enzyme was seen to have highest activity at pH 8.0 and 60°C. The enzyme was also showed to have resonable activity between pH5 and 9. 85% of the enzyme activity was retained at 70°C. Furthermore, amylase activities at 65 and 85°C were observed to remain stable for 5 and 2 hours, respectively. It was also showed that the activity was stable and pH7 and 9 for 6 hours. The effects of some metal ions, chemical agents and organic solvents on enzyme activity were examined so, Co+2, Mg+2,Ca+2 was determined to be as inducer for the enzyme activity. Conversely the activity was inhibited by Cu+2. Furthermore methanol, DDT and Triton X-100 was found to have no effect on the enzyme activity.
Benzer Tezler
- Cloning of a cDNA encoding laccase from coriolopsis polyzona MUCL 38443 and expression in Pichia pastoris
Coriolopsis polyzona MUCL 38443'ten lakkaz kodlayan bir cDNA'nın klonlanması ve Pichia pastoris'te ifade edilmesi
ORKUN PİNAR
Doktora
İngilizce
2017
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
PROF. DR. AYTEN KARATAŞ
- Biochemical characterization of recombinant 20S proteasome from Thermoplasma volcanium and cloning of its regulatory subunit gene
Thermoplasma volcanium, rekombinant 20S proteazomunun biyokimyasal karakterizasyonu ve düzenleyici alt birim geninin klonlanması
GÖZDE BAYDAR
Yüksek Lisans
İngilizce
2006
BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoteknoloji Bölümü
PROF.DR. MAHİNUR AKKAYA
PROF.DR. SEMRA KOCABIYIK
- Isolation, cloning, characterization and heterologous expression in Escherichia coli of Chlamydomonas reinhardtii pyruvate orthophosphate(Pi) Dikinase (PPDK) 1 gene
Chlamydomonas reinhardtii purivat ortofosfat(pi) Dikinase(PPDK) 1 geninin Escherichia coli'de klonlanması, karakterizasyonu ve heterolog ekspresyonu
TAHA TANGUT
Yüksek Lisans
İngilizce
2018
BiyomühendislikAkdeniz ÜniversitesiTarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. TARLAN MAMMEDOV
- Geobacillus kaustophilus fosfotransasetilazın rekombinant üretimi ve biyokimyasal karakterizasyonu
Geobacillus kaustophilus phosphotransacetylase: Recombinant production and biochemical characterization
MERAL AMANVERMEZ KARABAŞ
- Biochemical characterisation of truncated amylopullulanase from Thermoanaerobacter brockii brockii
Thermoanaerobacter brockii brockii kaynaklı amilopullulanaz enziminin kesilmiş varyantlarının biyokimyasal karakterizasyonu
AYCAN KAYRAV
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
Biyokimyaİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER
