İnsan karbonik anhidraz I (HCA I)geninin klonlanması, E.coli'de ekspresyonu ve Phe91Asn yönlendirilmiş mutageneziyle elde edilen mutant enzimin inhibitörlere karşı ilgisinin araştırılması
Cloning and expression of human carbonic anhydrase I(HCA I)gene in E.coli and investigation of affinity of the mutant enzyme to the inhibitors which is obtained site directed mutagenesis of Phe91Asn
- Tez No: 178030
- Danışmanlar: DOÇ.DR. FERAY KÖÇKAR, PROF.DR. OKTAY ARSLAN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Afinite kromatografisi, Ekspresyon, Glokom, nhibisyon, Karbonik Anhidraz, Klonlama, Yönlendirilmis mutagenez, Affinity choromatography, Carbonic anhydrase, Cloning, Expression, Glaucoma, nhibition, Site-directed mutagenesis
- Yıl: 2007
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Balıkesir Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
?nsan Karbonik Anhidraz (HCA I) (Karbonat hidroliyaz E.C. 4.2.1.1) 8. kromozomun uzun kolunda lokalize olan 30kDa büyüklüğünde bir proteindir. Eritrositlerde, kolon epitelinde, göz lensi ve korneal epitelyumda bulunur. Hücre içinde çözülebilir formda sitozolde yer alan HCA I eritrositlerde hemoglobinden sonra en bol bulunan proteindir. Yüksek göz içi basıncını düsürmek amacıyla glokom hastalığının tedavisinde kullanılan sülfonamidlerin HCA II izoenziminin yanında HCA I izoenzimini de önemli ölçüde inhibe ettiği saptanmıstır. Bu nedenle arastırmamızda sülfonamidlere karsı daha az ilgili mutant HCA I enzimleri elde edilmesi planlanmıstır. Bu amaçla insan hCA I geni, RT-PCR stratejisi ile HL60 hücre hattından pGEM-T vektörüne ve daha sonra pET21a(+) ekspresyon vektörüne klonlandı. Phe91 hidrofobik rezidüsü PCR 'a dayalı yönlendirilmis mutagenez stratejisi ile daha hidrofilik olan Asn rezidüsüne dönüstürüldü. Yabani ve mutant HCA I enzimlerinin ekspresyonu E.coli 'de gerçeklestirildi. Spesifik Sefaroz-4B-L-Tirozin afinite jeli kullanılarak saflastırıldı, hidrataz aktiviteleri belirlendi. Glokom tedavisinde sıklıkla kullanılan sülfonamid ve asetozolamide karsı inhibisyonu arastırıldı. Yabani tip HCA I enziminin aksine (IC50 = 1.257x10-4M), Phe91Asn mutantı, 0.468x10-4M IC50 değeri ile sülfonamide karsı daha yüksek afinite göstermistir. Asetozolamide karsı yabani (IC50 = 1.376x 10-6M) ve mutant (IC50 =1.283x10-6M) HCA I enzimleri arasında önemli bir inhibisyon farkı tespit edilmemistir.
Özet (Çeviri)
Human Carbonic Anhydrase (HCA I) (Carbonate hydroliyase E.C. 4.2.1.1) is a protein with 30kDa weight and situated on the long arm of chromosome 8. It presents in erythrocytes, colon ephithelium, lens of eye and corneal ephithelium. HCA I is the most abundant protein after hemoglobin in erythrocytes which is found in cytosol and has soluble form. It?s found that sulfonamides which are used in glaucoma treatment to reduce inner eye pressure in glaucoma, inhibit not only HCA II isoenzyme but also HCA I remarkably. For this aim, in this study it was planned to obtain mutant HCA I enzymes which have low affinity to sulfonamides. Therefore hCA I gene has been cloned from HL60 (Human acute myeloid leukemic cell line) by RT-PCR strategy and was cloned into pGEMT and subsequently into pET21a(+) expression vector. Phe91 hydrophobic residue was changed into more hidrophilic Asn residue with PCR based site directed mutagenesis. The expression of wild type and mutant HCA I enzymes was performed in E.coli. Wild and mutant HCA I enzymes were purified by specific Sepharose 4B-L-Tyrosine affinity gel and hydratase and esterase activities measured. Inhibition manner of these enzymes by Sulphonilamide and acetozolamide widely used for the treatment of glaucoma was investigated. Phe91Asn mutant (IC50 =0.468x10-5M) has higher inhibition affinity than wild type HCA I with IC50 values of IC50 = 1.257x10-5M to sulphonilamide. It wasn?t defined important inhibition difference of wild type (IC50 = 1.376x 10-6M) and Phe91Asn mutant enzyme (IC50 =1.283x10-6M) to acetozolamide.
Benzer Tezler
- Eritrositlerden karbonik anhidraz izoenzimlerinin saflaştırılması için yeni bir afinite jelinin sentezi ve uygulanması
Application and synthesis of a new affinity gel for the purification of carbonic anhydrase isoenzymes from the erythrocytes
ÖZEN ÖZENSOY
- Manyetik alanın insan eritrosit karbonik anhidraz izoenzimleri (hCA I ve hCA II)üzerine in vitro etkilerinin araştırılması
The investigation of effects of magnetic field on human erythrocytes carbonic anhydrase isoenzymes in vitro
SEMA COŞKUN
Yüksek Lisans
Türkçe
2007
BiyokimyaBalıkesir ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
DOÇ.DR. HAKAN KÖÇKAR
PROF.DR. OKTAY ARSLAN
- İnsan karbonik anhidraz 1 ve 2 izoenzimleri üzerine bazı ilaçların in vitro ve tavşanlar üzerinde in vivo etkisinin incelenmesi
The investigation of the effects of some antineplastic,analgesic and anesthetic drugs on erytrocyte carbonic anhydrase activity invitro and invivo
KONCA ALTINKAYNAK
- Saflaştırılmış farklı orijinli karbonik anhidraz enzimleri üzerine in vitro peroksinitrit muamelesinin etkilerinin incelenmesi
Investigation of the effects of in vitro peroxynitrite treatment over isolated carbonic anhydrase enzymes of various origins
MURAT KÜÇÜK
Doktora
Türkçe
2002
BiyokimyaKaradeniz Teknik ÜniversitesiBiyokimya Ana Bilim Dalı
PROF.DR. E. EDİP KEHA
- İnsan eritrositlerinde bulunan karbonik anhidraz izoenzimleri üzerinde bazı ilaçların aktivasyon ve inhibisyon etkilerinin incelenmesi
Investigation of activation and inhibition effects of some drugs on human erythrocyte carbonic anhydrase isozymes
ŞÜKRÜ BEYDEMİR