Pankreas adacık beta hücrelerinin flow sitometrik ve immünomanyetik izolasyonu
Flow cytmetric and immunomagnetic isolation of pancreatic islet beta cell
- Tez No: 157231
- Danışmanlar: PROF.DR. TEMEL YILMAZ
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Allerji ve İmmünoloji, Allergy and Immunology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2004
- Dil: Türkçe
- Üniversite: İstanbul Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: İmmünoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
6. ÖZET Pankreas adacık p hücrelerinin insülin sentez ve sekresyon fonksiyonlarının, intrensek özelliklerinin incelenmesi ve Diabetes Mellitus'un küratif tedavisini sağlayan p hücre transplantasyonunda karşılaşılan teknik, metabolik ve immünolojik sorunların ortadan kaldırılması için pürifiye P hücrelerinin izolasyonu gerekmektedir. Çalışmada p ve non-p hücrelerinin izolasyonunda FACS ve MACS sistemleri kullanılmıştır. Wistar Albino sıçanların adacık izolasyonu kollagenaz metodu ile yapılmıştır. FACS ile separasyon öncesi hücrelerine ayrılması için adacıklara Earle's-HEPES solüsyonu içinde süspansiyon haline getirilerek Tripsin ve DNAse I ile enzimatik sindirim uygulanmıştır. Percoll ile 2 kez santrifüj sonrası elde edilen canlı hücreler yeniden süspansiyon haline getirilmiştir. Hücreler Fluo-3 AM ile 40 dakika inkübe edilerek yüklenmiş ve 2 kez yıkama yapılarak inkübasyon medyumunun temizlenmesinden sonra hücre ayırımı FACSTAR PLUS flow sitometride yapılmıştır. MACS ile separasyon öncesi Earle's-HEPES solüsyonu içinde süspansiyon haline getirilen adacıklar pipet içine alıp boşaltılarak parçalanmaları kolaylaştırılmıştır. Hücre süspansiyonuna nötral proteinaz (dispase) eklenerek mekanik parçalama işlemine devam edilmiştir. Bütünlüğü bozulmamış adacık kalmadığı anda Percoll ile santrifügasyon ile canlı hücreler ayrılarak PBS içinde süspansiyon haline getirilmiştir. Hücreler R2D6 monoklonal antikor ile 30 dakika inkübe edilmiş, yıkanmış ve PBS ile süspansiyon haline getirilerek MACS rat anti-mouse lg M microbead eklenmiştir. 30 dakika inkübasyon ve santrifüjü takiben hücre süspansiyonu Mini MACS separatörün manyetik alanına yerleştilen MS+ kolondan geçirilerek 64non-p hücreler toplanmış, kolonun manyetik alandan ayrılmasından sonra PBS ile yıkanması ile de p hücreleri elde edilmiştir. Elde edilen p ve non-p hücrelerinin viabiliteleri, insulin, glukagon içerikleri ve eşleştirilmiş insülin/glukagon molar oranları incelenmiştir. İstatistiksel değerlendirmeler Student-t testi ile yapılmıştır. Adacıkların hücrelerine parçalanmasında nötral proteinaz kullanımı ve mekanik parçalama işleminin arttırılmasının elde edilen hücre sayısını Tripsin ve DNAse I ile parçalama işlemine göre istatistiksel olarak anlamlı derecede arttırdığı saptanmıştır ( p<0.01). MACS ile pürifiye edilen P hücrelerinin eşleştirilmiş insülin/glukagon molar oranlarının separasyon öncesi adacık hücrelerininkinden 7-8 kat yüksek olması hücrelerin fonksiyonel kapasitelerini koruduklarını göstermektedir. Canlılığını ve fonksiyonlarını koruyan, yüksek miktarda pürifiye p hücresinin kısa sürede ve basit bir yöntemle elde edilmesine olanak tanıması nedeni ile MACS ile p hücre ayırımı birçok laboratuarda kullanılmakta olan fakat temini zor ve pahalı cihaz, ekipman gerektiren ve uzun zaman alan flow sitometriye alternatif bir metoddur. 65
Özet (Çeviri)
7. SUMMARY FLOW CYTOMETRIC AND IMMUNOMAGNETIC ISOLATION OF PURIFIED PANCREATIC BETA CELLS The isolation of the purified p cells is necessary for the investigation of insulin synthesis, secretory functions and intrinsect properties and to overcome the technical, metabolic and immunological problems in p cell transplantation for the curative treatment of Diabetes Mellitus. In this study FACS and MACS systems were used for the isolation of the P and non-P cells. The islet isolation of Wistar albino rats were done with collagenase method. Before the purification by FACS islets cells were suspended in Earle's- HEPES solution and dispersed by enzymatic digestion with Tripsine and DNAse I. After 2 consecutif centrifugations with Percoll viable dispersed islet cells were recovered and resuspended. Dispersed islet cells were loaded by the incubation for 40 minutes with Fluo-3 AM and washed two times for the removal of the incubation medium. Cell sorting was made on a FACSTAR PLUS flow cytometer. Before the purification by MACS islets cells were suspended in Earle's- HEPES solution and cell dispersion was initiated mechanicly with Gibson pipette movements. Than the islet cells were dispered by the addition of neutral proteinase to the cell suspension, followed-up by the mechanical dispersion. When a II of t he islets were dispersed cell suspension was centrifugated with Percoll and resuspended in PBS. Recovered dispersed cells were incubated for 30 minutes in the presence of R2D6 monoclonal antibody, washed and resuspended in PBS mixed with MACS rat anti-mouse Ig M microbeads. After 30 minutes incubation and centrifugation, cell suspension was applied onto a 66MS+ column placed in the magnetic field of a Mini MACS separator. The non~p cells passed through and were collected. After the removal of the column from the magnet, the p cells were flushed out with PBS. The viability of the obtained p and non-p cells, their insulin and glucagon content, and the matched insulin/glucagon molar ratio were investigated. Statistical analysis was carried out with Student-t test. The use of neutral proteinase and increased use of mechanic procedure for the dispersion of the islets cells has been found to significantly increase the number of obtained dispersed cells compared to the procedure using Trypsin and DNAase I (p<0.01). The insulin/glucagon paired molar ratio of p cells purified with MACS is 7-8 times higher than in dispersed islet cells before separation. This shows that the purified cells protect their functional capacity. The p cell isolation using MACS makes possible to obtain high number of purified p cells with protected functions and viability in short time with a simple procedure. Therefore it is an alternative method to the flow cytometry which is used in many laboratories but which needs long time, a teamwork and equipment expensive and difficult to obtain. 67
Benzer Tezler
- Yeni doğan streptozotocin diabetik sıçanlarda pankreatik beta946; hücre rejenerasyonu.
Regeneration of Pancreatic Beta Cells in Neonatal STZ Diabetic Rats.
FATMA KAYA DAĞISTANLI
Doktora
Türkçe
2006
Tıbbi Biyolojiİstanbul ÜniversitesiTıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
PROF.DR. A. GÖKHAN AKKAN
PROF.DR. MELEK ÖZTÜRK
PROF.DR. SELMA YILMAZER
- Tavuklarda pankreasın yapısal ve histokimyasal özellikleri alloxan verilmiş tavuklarda endokrin pankreasta görülen değişiklikler üzerinde araştırmalar
Structural and histochemical characteristics of pancreatic glands and histological changes in the endocrin portion, following alloxan administration to hens
MİNE YAKIŞIK
Doktora
Türkçe
1988
Veteriner HekimliğiUludağ ÜniversitesiHistoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. AYTEKİN ÖZER
- Tip 2 diabette makrovasküler komplikasyonlar açısından serum sitokin (Tümör nekroz faktör-alpha ve interlökin-1 beta) düzeylerinin ve lipid peroksidasyonunun değerlendirilmesi
The Assessment of serum cytokine levels and lipid peroxidation in type 2 diabetes mellitus according to macrovascular complications
SEVAL AYDIN
- Tip II Diyabetes mellitusda prokalsitonin düzeyleri
Procalcitonin levels in Type II Diabetes mellitus
MEHMET ALİ SÖYLEMEZ
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2005
Fizyolojiİstanbul ÜniversitesiFizyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. OKTAY SEYMEN
- DADLE (D-Ala, D-Leu)-enkefalin opioid peptidinin xenotransplantasyon yapılan beta adacık hücreleri üzerine etkisi
The Effect of DADLE-enkephalin opioidpeptid on the longevity of xenografted islet beta-cells
MELDA AKSOY
Yüksek Lisans
Türkçe
2000
Endokrinoloji ve Metabolizma HastalıklarıSelçuk ÜniversitesiTıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AHMET ARSLAN