Cloning sequencing and expression of L-lactate dehydrogenase gene from Clostridium thermocellum and isolation, characterization and transformation of various cellulolytic, thermophilic, ethanol-producing bacteria
Clostridium thermocellum'dan L-laktat dehidrogenaz geninin klonlanması ekspresyonu ve çeşitli sellülolitik, termofilik, etanol üreten bakterilerin izolasyonu, karakterizasyonu ve transformasyonu
- Tez No: 119478
- Danışmanlar: PROF. DR. GÜLAY ÖZCENGİZ, DOÇ. DR. ZÜMRÜT ÖGEL
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Clostridium thermocellum, L-laktat dehidrogenaz, gen klonlanması, sellülolitik bakteriler, termofiller, etanol üreten bakteriler, anaeroblar. doğal kompetent bakteriler. vm, Anaeroblar, Bakteriler, Ekspresyon, Gen klonlama, Clostridium thermocellum, L-lactate dehydrogenase, gene cloning, cellulolytic bacteria, thermophiles, ethanol producing bacteria, anaerobes, naturally competent bacteria, Bacteria, Expression
- Yıl: 2002
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
oz CLOSTRIDIUM THERMOCELLUM'DAN L-LAKTAT DEHİDROGENAZ GENİNİN KLONLANMASI, EKSPRESYONU VE ÇEŞİTLİ SELLÜLOLİTİK, TERMOFİLİK, ETANOL ÜRETEN BAKTERİLERİN İZOLASYONU, KARAKTERİZASYONU VE TRANSFORMASYONU Özkan, Melek Doktora, Biyoteknoloji Tez Yöneticisi: Prof. Dr. Gülay Özcengiz Yardımcı Tez Yöneticisi: Doç. Dr. Zümrüt Ögel Ağustos, 2002, 140 sayfa Bu çalışmada, Clostridium thermocellum 27405 susundan L-laktat dehidrogenaz enzimini (LDH, EC. 1.1. 1.27) kodlayan gen Escherichia coli ' de ilk kez klonlanmış ve karakterize edilmiştir. Polimeraz zincir reaksiyonu sonucunda elde edilen 357'bp lik ürün, C. thermocellum Lambda Zap II faj gen kütüphanesini taramak için prob olarak kullanılmıştır. Pozitif klondan elde edilen plazmidin 2.5 kb'lık bir DNA parçası taşıdığı saptanmış ve sekans analizi sonucunda bu DNA parçasının 948 bp lik Idh genini içerdiği tespit edilmiştir. C. thermocellum LDH amino asid diziliminin Clostridium perfringens, Bacillus stearothermohilus, Thermus caldophilus, and Lactobacillus casei LDH ezimlerinin amino asid dizilimleriyle olan benzerliği sırasıyla % 57.1, %48.9, % 41.5, and % 47.1 olarak bulunmuştur. vıC. thermocellum' xm G+C kontentinin düşük olmasının kodon kullanımını etkilediği, sonu A ya da T ile biten kodonların daha fazla kullanıldığı belirlenmiştir.. Genin 5' bölgesinde tespit edilen ribozom bağlanma ve promotor bölgeleri diğer clostrial genlerle benzerlik göstermektedir. Klonlanan gen E. colfde başarıyla ifade edilmiştir. C. thermocellum LDH enziminin allosterik bir enzim olduğu ve fructose 1,6 diphosphate tarafından aktive edildiği saptanmıştır. Ayrıca genin E. coli'de lac promoted tarafından ifade edilebildiği ve IPTG tarafından gen ifadesinin arttığı tespit edilmiştir. Araştırmanın ikinci bölümünde, transformasyonu başarılmış endüstriyel bir C. thermocellum suşunun mevcut olmaması ve bilinen C. thermocellum suşlanmn etanol selektivitelerinin düşük olması sebebiyle doğadan termofilik, anaerobik. sellülolitik, etanol üreticileri izole edilmiş ve çeşitlilikleri saptanmıştır. Bilinen iki standard suş ve onüç yeni izole edilmiş suşlar sellüloz kullanımı, antibiyotik dirençliliği, koloni morfolojisi ve fermentasyon ürünleri açısından kıyaslanmalardır. 16SrRNA geni için düzenlenmiş primerler kullanılarak suşların C. thermocellum ile olan genetik yakınlıklarına bakılmıştır. Ayrıca suşların hidrogenaz ve fosfotransasetilaz/asetat kinaz enzim genleri arasındaki homoloji de yine PCR metodu kullanılarak karşılaştırılmıştır. Onüç sustan ikisi (7-10-1, 7-12-1) bu genlerin çoğu için C. thermocellum 'dan farklılık göstermiş olup bu suşların filogenetik olarak C. thermocellum“ dan. çok farklı oldukları düşünülmektedir. Sellülolitik izolatların sellülozom sistemlerinin bir parçası olan sellüloz bağlanma proteinlerine karşılık gelen gen dizileri PCR yoluyla çoğaltılmıştır. 9 izolat için elde edilen amplikonların sekans analizleri sonucunda izolatlann sellüloz kullanma kapasiteleri ile sellüloz bağlanma proteinlerinin amino asit dizilimleri arasında doğrudan bir ilişki saptanamamıştır. Suşlara PEG elektroporasyon ile gen transferi yapılmaya çalışılmış, ancak transformasyonları mümkün olmamıştır. Transforme edilebilir bir termofilik. sellülolitik, etanol üreticisi izole etmek amacıyla ”karışık kültür transformasyonu" adı verilen bir teknik geliştirilmiştir. Bu özellikleri taşıyan bakteriler doğada diğer bakterilere kıyasla son derece nadir bulunduğundan bu teknik kullanılarak kompetent bir sellüloz kullanıcısı elde edilememiş, ancak termofilik, kompetent, anaerobik bakteriler elde edilmiştir. Böyle bir susun transformasyonu sonucunda transfer vıı t:©KUM*NTAS¥©N ÜRİettiğimiz plasmid yapısal değişikliğe uğramıştır. Kıyaslanan restiriksiyon enzim bölgelerinden yalmzca dört tanesi değişiklik göstermezken diğer pek çok restriksiyon bölgesinin kaybolduğu ya da sonradan oluştuğu görülmüştür.
Özet (Çeviri)
ABSTRACT CLONING, SEQUENCING AND EXPRESSION OF L-LACTATE DEHYDROGENASE GENE FROM CLOSTRIDIUM THERMOCELLUM AND ISOLATION, CHARACTERIZATION AND TRANSFORMATION OF VARIOUS CELLULOLYTIC, THERMOPHILIC, ETHANOL-PRODUCING BACTERIA Özkan, Melek Ph. D., Department of Biotechnology Supervisor: Prof. Dr. Gülay Özcengiz Co-Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Zümrüt Ögel August, 2002, 140 pages In this study, the structural gene for L-lactate dehydrogenase (LDH; EC. 1.1. 1.27) was cloned and characterized for the first time from Clostridium thermocellum 27405 in Escherichia coli. A 357 bp PCR product of predicted size was obtained with degenerate primers designed for conserved regions of Idh genes of different organisms. This amplicon was used as a probe to screen a Lambda Zap II phage library of C. thermocellum genomic DNA. One positive clone contained an insert of 2.5 kb which included an open reading frame of 948 base pairs. The amino acid sequence of the C. thermocellum LDH showed high homology to those of Clostridium perfringens, Bacillus stearothermophilus, Thermus caldophilus, and Lactobacillus casei, with respective identities of 57.1 %, 48.9 %, 41.5 %, and 47.1 %. The low G+C ratio (40 %) of the C. thermocellum genome affects codon usage, 111thus codons ending with A or T at the third position are mostly utilized in the C. thermocellum Idh. A putative ribosomal binding site and promoter region located in the 5' flanking region show high similarity to those of other clostridial genes. The gene was successfully expressed in E. coli FMJ39 {Idh mutant) under the lac promoter. C. thermocellum LDH was shown to have a highly reversible activity and to be an allosteric enzyme which is activated by fructose 1,6 diphosphate. As the second part of this research, various thermophilic, cellulolytic, ethanol producers isolated from different environmental samples were characterized in the context of biomass conversion processes; transformability and high ethanol selectivity were the main issues. Transformation efficiencies of the isolates were investigated since the genetic transformation of the type strains of C. thermocellum has not been achieved to date. Two previously described strains and thirteen newly isolated strains were also compared with respect to rates of cellulose degradation, antibiotic sensitivity, morphology and fermentation endproducts. Phylogenetic relationships of the isolates with C. thermocellum were detected using primers designed for 16SrRNA. Homology in the sequences of hydrogenase and phosphotransacetylase/acetate kinase genes were also compared by PCR. Two strains out of thirteen (7-10-1, 7-12-1) did not give any amplicon with the primers used for most of these genes, indicating that they are probably phylogenetically distant from C. thermocellum. Homologs of the cellulose binding domains (CBDs) of cellulosomes of the cellulolytic isolates were amplified by PCR. Sequence analysis of the amplicons for 9 strains showed that the differences in cellulose degradation capacity of the natural isolates was not directly linked to the amino acid sequence of CBDs. Attempts were also made to transform the isolates by PEG electroporation but none of them was transformable. A technique called“mixed culture transformation”was developed with the aim of isolating competent strains of thermophilic, ethanol producing, cellulolytic bacteria which are apparently extremely rare in nature. Although we could not isolate a cellulolytic strain transformable by our techniques, we obtained thermophilic, anaerobic, competent bacteria. It was shown that plasmid pHV33 rearranged in thermophilic anaerobic transformant. Restriction mapping of IVthe rearranged plasmid indicated that four restriction sites were unchanged while many restriction sites had been lost or formed.
Benzer Tezler
- Cloning, characterization and expression of Arabidopsis thaliana G protein alpha subunit gene for structural studies
Arabidopsis thaliana'daki G protein alfa altbirim geninin yapısal çalışmada kullanılmak üzere klonlanması, karakterizasyonu ve ekspresyonu
EMİNE SÜPHAN BAKKAL
- Cloning, characterization and heterologons expression of the aspartokinase and aspartate semialdehyde dehydrogenase genes from the cephamycin C producer streptomyces clavuligerus
Sefamisin C üreticisi streptomyces davuligerus'un aspartokinaz ve aspartat semialdehid dehidrojenaz genlerinin klonlanması, karakterizasyonu ve heterolog ekspresyonu
SEDEF TUNCA
Doktora
İngilizce
2002
BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. GÜLAY ÖZCENGİZ
PROF. DR. JACQUELİNE PİRET
- Cloning, expression and sequencing of citrate synthase from Thermoplasma volcanium
Thermoplasma volcaniumun sitrat sentaz geninin klonlanması, ekspresyonu ve nükleik asit diziliminin belirlenmesi
ÇAĞLAR ÇEKİÇ
Yüksek Lisans
İngilizce
2004
BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. SEMRA KOCABIYIK
PROF. DR. MAHİNUR AKKAYA
- Cloning and expression of TaqI restriction endonuclease gene using pmal-c2 vector system in different straints of escherichia coli
TaqI restriksiyon endonükleaz geninin pmal-c2 vektör sistemi kullanılarak değişik escherichia coli suşlarında klonlanması ve ekspresyonu
ELİF ÖZKIRIMLI
Yüksek Lisans
İngilizce
1998
Kimya MühendisliğiBoğaziçi ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF.DR. BETÜL KIRDAR
- Cloning, characterization and expression of a novel metallothionein gene (mt-d) from Triticum durum
Triticum durum'dan yeni bir metalotionin (mt-d) klonlanması, karakterizasyonu ve gen anlatımı
HASAN ÜMİT ÖZTÜRK